酶联免疫试剂盒：ELISA常见3种检测法

  科研工作者可以借用ELISA试剂盒分析每个样本中存在特定抗原或抗体浓度。ELISA原理将待检测抗原或抗体固定在微孔板上。然后，加入与目标抗原或抗体特异性结合的检测抗体。该检测抗体通常与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等酶偶联。在加入相应的底物后，酶催化底物发生反应，产生可检测的颜色变化或发光信号。通过酶标仪读取信号强度，可以确定样本中目标抗原或抗体的浓度。

图1 elisa原理

  显色分析

  这是目前最常用的方法，它也叫比色测定，其结果是产生有色反应终产物，该终产物吸收可见光。已知反应产物的光密度读数与被检测的分析物的量成正比。

  对于此过程，辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)偶联抗体通常与显色底物溶液(3,3′,5,5′四甲基联苯胺，TMB)一起使用。TMB被视为一种极其敏感的底物，它可以产生可在650nm波长下测量的蓝色。

  对于大多数比色测定，使用过氧化物酶或磷酸酶就足够了。这两种酶都可以与许多不同的底物一起使用，以产生定性或定量的ELISA结果。另一个重要点是这些底物可以产生有色的可溶性反应产物。这是进行ELISA测试时的想法。

  有许多因素会影响酶活性测量。影响ELISA的一些最常见因素包括温度、pH条件、反应时间、底物消耗、缓冲液成分、离子强度、酶变性、光照、蛋白质抑制剂的积累以及由于产品浓度增加而导致的逆反应增加。对于所有市售试剂盒，所有这些条件和因素都已优化，以确保每次都能产生准确的结果。

  此外，该方法反应速度快，非常适合任何动力学分析。该程序依靠吸光度来确定读数，然后可以使用标准曲线确定分析物的未知浓度。

  荧光分析

  这些免疫测定法是显色测定法的简单变体。唯一的区别是HRP或AP偶联检测抗体使用荧光底物而不是比色底物。一般来说，这种方法提供稍高的信号和更宽的动态范围。与比色法设定的2.0-4.0OD限值相比，这可以更准确地测量更高的读数。这种方法的一个缺点是与比色底物相比，荧光底物的半衰期较短。

  该检测法的一些特性包括：与比色法相比，灵敏度高100倍，效率高，不使用放射性物质，安全且相对容易使用。但是，它会产生背景荧光干扰（可以使用黑色微孔板将其最小化），并且需要荧光计来读取信号（这是一种相当昂贵的设备）。

  目前市场上有许多不同的荧光计。在选择特定仪器时，需要考虑的一些特性包括：可调节光检测器、读数室内的热一致性、数值可调增益、混合和匹配发射和激发波长、内部背景控制机制、顶部和底部检测的选择、选择每个孔的持续时间和读取次数的选项。

  化学发光分析

  发光测定被认为是标准ELISA程序的变体，与荧光免疫测定非常相似。本质上，使用酶将底物转化为反应产物，该过程导致以质子形式发光。这种测定中常用的一些酶是HRP和AP。

  发光过程可以定义为物质从电子激发态返回基态时发出的光。当激发中间体返回基态时会释放出质子。释放的质子可以用可以测量发光信号的设备来检测。

  发光有很多种形式，最常见的是化学发光、光致发光和生物发光。它们之间唯一真正的区别是达到激发态的方式。

  1.化学发光：光是由于化学反应产生的。

  2.光致发光：这是一种简单的荧光过程，激发是由特定波长的光引起的。

  3.生物发光：使用具有生物发光特性的化合物，例如萤火虫荧光素酶和荧光素。

  ELISA检测最常用的方法是化学发光和生物发光。这些方法具有灵敏度高和动态重测范围广的优点。测量的是相对光单位(RLU)，它们往往与样本中存在的分析物量成正比。

  可以得出结论，上述每种检测方法都有各自的要求，但是，通过这三种方法，可以开发出一种高度灵敏、精确和可重复的检测方法，从而获得一般准确的结果。

  无论使用哪种方法，都有一些需要考虑的共同参数，例如使用适合所采用的方法和应用的酶标签、选择正确的酶和底物、创建优化条件，最后使用正确的仪器进行测量。