奔马赭霉染料法荧光定量PCR试剂盒
产品及特点:
1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。
2. 根据奔马赭霉保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
规格及成分:
编号
|
成分
|
规格
|
试剂一
|
2×qPCR MagicMix
|
500 μL(棕色管)
|
试剂二
|
荧光 PCR 专用模板稀释液
|
1 mL(黄盖)
|
试剂三
|
奔马赭霉染料法PCR 引物混合液
|
100 μL(白盖)
|
试剂四
|
奔马赭霉染料法PCR 阳性对照(1×10E8 /μL)
|
50 μL(红盖)
|
试剂五
|
DNA 病毒裂解液(试用装)
|
15 次(9 mL)
|
|
使用手册
|
1 份
|
运输及保存:
低温运输、-20℃保存,有效期一年。
自备试剂:
DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。
使用方法:
一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6 个 10倍稀释度为例) :
1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液(最好用带芯枪头,下同)。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备 :
8. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝)或第 5 号(浓度为 1×10E5拷贝/μL,10μL 相当于 10 万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品,则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
9. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 15 次一管式病毒 DNAout。
三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行) :
10. 如果只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复,则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
成分
|
样品管 N+2 个
|
PCR 阴性 对照管
|
PCR阳性对照管(2-7 管)
|
2×qPCR MagicMix (棕色管)
|
10μL
|
10 μL
|
各 10 μL
|
奔马赭霉PCR引物混合液(白盖)
|
2 μL
|
2 μL
|
各2 μL
|
N+2 待测样品DNA模板
|
6 μL
|
不加
|
不加
|
自备10×ROX (见注)
|
2 μL
|
2 μL
|
各2 μL
|
第7步所得PCR阳性对照
稀释液(2-7 号)
|
不加
|
不加
|
各 6μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…)
|
注: 仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照,其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。
12.盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
过程
|
温度
|
时间
|
预变性
|
92℃
|
5分钟
|
PCR反应30个循环
|
94℃
|
60秒
|
50℃
|
60秒
|
72℃
|
60秒
|
13. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时,最大吸收光谱在 471 nm,结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm,最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理:
14. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值,再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。