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从40亿年前微生物的出现，到单细胞生物，再到脊椎动物，直至我们现在的人类，经历了漫长的进化过程。除了各时期物种形态上显而易见的变化外，作为组成一切生命体物质基础的蛋白质，也在随着周围环境的变化而不断发生改变。它们通过结构上的不断复杂化形成多聚体，可以衍生出各种新的功能，例如配体结合的协同效应以及变构调节作用等，从而使生物能够适应其生存环境而不被淘汰。那么，绝大多数蛋白质的多聚体结构及其对应的功能，是如何在进化过程中被衍生出来的呢? 在传统的认知里，形成多聚体这样精巧的结构需要复杂的进化过程，一般认为其间经历了多个氨基酸的替换和漫长的选择，最终才得到形成多聚体的能力。然而，这种观点又是否正确呢？
为了探索这个问题，近日美国芝加哥大学研究人员选取了血红蛋白这个体系来进行了深入的分析。血红蛋白是存在于高等生物红细胞中介导氧气运输和交换的一种蛋白质。在大多数脊椎动物中，血红蛋白是由两个α亚基和两个β亚基组成的异源四聚体。其中，每个亚基具有与肌红蛋白相似的结构，即各亚基中的肽链都会盘绕折叠成球形，内联一个血红素辅基，通常我们将这种球形结构称为珠蛋白。
血红素辅基是血红蛋白和肌红蛋白能够携氧的关键所在。它是由一个卟啉环和一个铁原子组成。2价的铁原子位于卟啉环中央，它有6个配位键，其中4个与卟啉环平面的N原子结合，两个与卟啉环平面垂直，当血红素辅基垂直插 入肽链疏水空腔时，第五个配位键将连在珠蛋白肽链中第8位的组氨酸残基的吲哚环侧链的氮原子上，这种结构允许铁通过共价键与氧或其他气体结合在亚铁血红素的远端口袋，以完成6个配体的八面体配位。
血红蛋白与氧的结合及释放一个非常神奇的过程：当红细胞在肺部毛细血管等氧含量高的地方中穿行时，红细胞中的血红蛋白能够快速与氧结合，然后通过血液循环将氧运输至全身各处。而当红细胞经过CO2浓度较高的组织时，血红蛋白又容易与氧分离，然后将氧释放出来，以保证对各组织的供氧需求。血红蛋白的这种高效携氧和释放氧的现象称为协同效应。它与血红蛋白的四级结构及其构象变化密切相关。血红蛋白具有T和R两种状态，也就是拉紧状态和松弛状态：当没有结合O2时，血红蛋白主要是T状态，这种状态下血红蛋白对O2的亲和性很低；而当血红蛋白中的一个亚基与氧相结合时，所有亚基都会发生运动，引起四个亚基相对空间位置的变化，使两个α亚基相互接近，两个β亚基则远离，由T状态迅速变成R状态。这个变化会增加其余亚基对氧的亲和力，从而使血红蛋白在肺中可以迅速与氧结合。反之，当氧合血红蛋白处于CO2浓度较高的环境或酸性环境下时，CO2和H+将充当变构抑制剂，降低血红蛋白对O2的结合能力，当氧合血红蛋白的一个亚基发生解离时，由于构象的变化也会使其余亚基更容易解离。这样，血液进入氧含量低的组织中时，血红蛋白就会迅速将氧放出，从而起到高效运输氧气的作用。
目前科学家普遍认为，血红蛋白和肌红蛋白在很久之前是通过同一个祖先-那时候的血红蛋白还是保持着单体形态的，那么它是怎么逐步进化成今天的异四聚体形态的呢？为了探索血红蛋白的异源四聚体结构及对应功能的进化起源，研究人员先根据收集获得的177条来自脊椎动物（也就是从鱼类到哺乳类）的包含血红蛋白和肌红蛋白在内的多种珠蛋白代表性序列，绘制了系统发育树并重构出了重要节点的祖先序列：α亚基的祖先蛋白Ancα（图中粉红色圆圈所示）、β亚基的祖先蛋白Ancβ（图中蓝色圆圈所示）、α亚基和β亚基共同的祖先蛋白Ancα/β（图中紫色圆圈所示）以及肌红蛋白和血红蛋白的共同祖先蛋白AncMH（图中紫色圆圈所示）。拿到这些祖先蛋白序列之后，研究人员将他们表达纯化出来，并用质谱、排阻色谱和多角度光散射等实验对它们的组装方式等特性进行了表征。首先，根据实验结果研究人员发现，将Ancα和Ancβ放在一起共表达时，二者可以形成像现代血红蛋白那样的异源四聚体，其解离常数为10微摩左右，和现代人类血红蛋白的解离常数（15微摩）基本一致；而将Ancα和Ancβ单独表达的话，可以看到Ancα之间只能形成同源二聚体，Ancβ之间形成的是同源四聚体，Ancα/β可以形成同源二聚体结构，但不能组装成四聚体；而AncMH是一个单体。因此研究人员推测，Ancα/β同源二聚体是介于AncMH单体和现代血红蛋白异源四聚体之间的中间过渡态。
接下来，研究人员通过分析这些祖先蛋白的氧结合特性来反应血红蛋白功能特性的进化。在前面的背景里我们了解到，现代的血红蛋白能够通过变构效应协同性结合或释放氧。变构调节分子如六磷酸肌醇（简称IHP）等通过结合到血红蛋白的β亚基中可降低血红蛋白对氧的亲和性。P50是指血红蛋白氧饱和度为50%时的氧分压，它是反应血红蛋白与氧结合亲和力的常用指标。当P50减小时，意味着血红蛋白与氧的亲和力增加，氧不易从血红蛋白中释放出来；反之当P50值增大时，则说明血红蛋白与氧的亲和力减少。希尔系数n则是反应各亚基协同效应的一个指标。研究人员通过对Ancα/β以及Ancα和Ancβ的共表达产物加以IHP处理之后观察到，Ancα/β组的P50值和希尔系数均基本无变化，说明Ancα/β不具有变构作用及对应的协同效应；而Ancα+Ancβ组加入IHP之后，P50和希尔系数n均增加了，从而可以看出Ancα和Ancβ的共表达产物有着类似现代血红蛋白的功能。这些实验结果证实结构与功能之间相互对应的关系，Ancα/β由于缺乏四聚体结构，无法像血红蛋白那样能够协同结合或释放氧。从而也再次说明，血红蛋白的变构作用及协同效应与形成的异源四聚体密切相关。
血红蛋白之所以能够保持四聚体的模样，是因为有两个关键的界面：IF1和IF2在发挥着主导作用，其中IF1主要负责连接α1-β1、α2-β2；IF2，IF2z则主要负责连接α1-β2、α2-β1。那么，这两个界面在进化的过程中到底是哪个先出现，哪个后出现呢，研究人员接下来应用氢氘交换质谱(HDX-MS)技术重点分析了这两个界面的进化情况。氢氘交换质谱(HDX-MS)技术的主要原理是：暴露在溶剂中的残基吸收氘的速度比掩埋的残基快，因此，二聚体界面的肽段在当单体状态占主导地位的溶液环境中会比在二聚体状态占主导地位的溶液环境中表现出较高的氘吸收量。研究人员通过测量含有IF1界面处残基的肽段（即第106位到111位氨基酸）处的氘吸收量验证了这个观点。在b图中，绿色标注的这条曲线和0.67微摩对应的这条曲线中，绝大多数的Ancα/β都是处于单体状态，而75微摩的溶液环境中，Ancα/β主要是呈现二聚体形式。从图中的结果我们可以看到，在偏向形成单体的溶液环境中氘吸收量远远高于偏向形成二聚体的溶液环境中的氘吸收量。此外，通过测量比较含不同区域残基的肽段在0.65μM和75μM溶液中的氘吸收量，研究人员发现含有IF1界面处的氨基酸残基对应的肽段在两种不同溶液环境中的氘吸收量的差异性是最大的，而含IF2界面处残基的肽段其氘吸收量基本无差异。这说明在Ancα/β形成的二聚体中，只存在IF1这个界面，而不存在IF2这个界面，IF1界面对于Ancα/β的二聚体化非常重要。之后研究人员通过突变实验再次验证了这个结论，他们发现，将IF1界面中的残基突变之后会严重损害Ancα/β的二聚化，突变后的Ancα/β全变成了单体状态；但突变IF2界面处的残基时则不会对Ancα/β的寡聚化状态产生影响。
因此，研究人员推测，IF1界面是在Ancα/β之前就已经存在的，Ancα/β可以通过IF1界面形成二聚体，之后随着进化的发展衍生出了IF2界面，后续β亚基就能通过该界面再由二聚体组装成四聚体。这一发现也解释了为什么前面观察到的Ancα/β既不具有协同性也不具有变构调控作用的现象，因为这两种功能都需要IF2介导组装成四聚体。
那么，这个有利于介导组装四聚体的IF2界面是如何进化而来的呢?研究人员接下来通过比较各祖先蛋白的氨基酸差异性，并结合突变实验找到了答案。通过比对，他们发现，Ancα/β与Ancα之间只存在3个差异氨基酸，包括一个替换和两个缺失。而Ancα/β与Ancβ之间存在42个差异氨基酸, 这其中有4个位于IF1界面处，5个位于IF2界面处。接下来，研究人员根据这些差异氨基酸构造了一系列的突变体。例如，将5个存在于Ancβ的IF2界面处的氨基酸突变回Ancα/β中构成了Ancα/β5这个突变体，将该突变体与Ancα共表达之后，能够形成同源四聚体也能形成异源四聚体；而将其中4个氨基酸突变回Ancα/β中构成了Ancα/β4这个突变体后发现，将该突变体与Ancα共表达只能形成同源四聚体。这说明第5个差异氨基酸，也就是h104E对于异源四聚体的形成至关重要。随后研究人员又挑选了除H104E之外的任意两个存在于IF2界面处的氨基酸进行突变形成Ancα/β2之后发现，它们都能形成四聚体。这说明IF2新界面的形成还是很简单的，只要两个突变就能实现，没有想象中的那么复杂。从上面构造的这些突变，我们能够看到，不管是β5、β4还是β2突变体，他们都不能特异性形成像血红蛋白那样的α2β2型异源四聚体，于是他们假设位于IF1界面的4个差异氨基酸对于四聚体的异质性非常重要。通过IF1先形成了异源二聚体，然后再通过IF2接口组装成四聚体（之前Ancα/β中的都是同源二聚体）。因此，接下来他们在Ancα/β5这个突变体的基础上再把位于IF1界面上的四个氨基酸也进行了回复突变，形成了Ancα/β9突变体。与预测相一致的是，当Ancα/β9突变体与Ancα共表达时，主要存在的是异源二聚体和异源四聚体这两种形态。因为Ancα/β9和Ancα的共表达物的溶解性不是很好，影响了质谱对多聚体结构的定量分析，所以研究人员又把位于界面临界处的另外5个氨基酸也进行了突变，构成了Ancα/β14突变体，当该突变体与Ancα共表达的时候，其溶解性得到了大大的改善，并且质谱结果表明其主要的形态是α2β2型异源四聚体。从这可以看出，IF2的出现引起了蛋白的四聚体化，而IF1界面处的差异氨基酸残基对于异质特异性至关重要。从Ancα/β同源二聚体到血红蛋白的异源四聚体只需要替换掉位于两个界面中的少数几个氨基酸残基就能实现。
那么，如此少的氨基酸替换是如何产生一个新的、特定的多聚体相互作用的呢，研究人员接下来探索了新界面形成的结构机制。首先，研究人员利用同源建模获得的异源四聚体模型，确定了祖先蛋白上介导各界面相互作用的所有有利关联。然后结合进化树，来判断了这些残基的进化情况。B图和C图分别展示的是存在于IF界面处和IF2界面处的各亚基中氨基酸残基之间的相互作用。图中实线表示的是氢键，虚线表示的是范德华力。左边这一列是存在于Ancα/β14亚基（相当于血红蛋白中的β亚基）中的氨基酸，右边表示的是Ancα亚基中的氨基酸。每个氨基酸从外到里分别对应的是在AncMH、Ancα/β和Ancα或Ancα/β14中存在的状态，因此可以很清楚的看到这些有相互作用的氨基酸的进化情况。例如，图中黑色标识的这些氨基酸都是从AncMH到Ancα或Ancα/β14中始终保持保守状态的一批氨基酸，红色标识的氨基酸表示的是从Ancα/β时期才开始变化的，而蓝色标识的氨基酸则是近期才发生变化的。从图中的这些相互作用我们可以看出，不仅是后来变化的氨基酸之间能产生相互作用以促使新界面的生成，之前一些非常保守的氨基酸也会被招募进来发挥重要的作用。例如：在IF1和IF2界面处，Ancα中的这些能和Ancα/β14产生相互作用的氨基酸从Ancα/β时期就没有发生过变化。又如，每个亚基上的R33都能和对面亚基上的F125(苯丙氨酸)形成2个氢键，而这两个氨基酸都是在AncMH之前就已经存在的。所以新增的这些氨基酸替换可以在原有这些进化比较早的氨基酸之间的比较弱的相互作用的基础上，迅速增加多聚体的占位，这也从结构层面上解释了新界面出现及多聚体形成的原因。
最后，研究人员探究了Ancα+Ancβ的协同性的进化过程。从前面的结果我们可以看到，Ancα/β中没有变构效应和协同性，但Ancα和Ancβ的共表达物却具备这两种功能，这是怎么来的呢？我们已知，现代血红蛋白的协同性涉及到两种构象，一种是对氧有高亲和性但是IF2界面处的相互作用比较弱的R态，而另一种是作用正好相反的T态。协同性通常是由连接了血红素辅基和IF2界面的螺旋上一系列的氨基酸残基所介导的，研究人员将这群氨基酸称为变构核心区域。为了了解协同性产生的进化机制，研究人员检查了血红素辅基口袋和变构核心区域中氨基酸残基的进化情况。图A表示的是Ancα+Ancβ通过同源建模获得的模型，其中这些球形表示的是以血红素为中心4埃范围内的位于Ancβ亚基上的氨基酸残基，不同的颜色表示不同的进化情况，其中灰色表示的是从AncMH之后都没有发生变化的残基，紫色表示的是Ancα/β起开始发生变化的残基。从图中的结果我们可以看到，在已获得协同性的蛋白模型中，没有氨基酸发生过变化，绝大多数氨基酸都是在AncMH之前就已经获得的，这其中包括近端组氨酸（深灰色的地方），它能共价结合血红素铁，并能将血红素与氧结合的信息传导至变构核心区域和IF2界面处，从而导致其他亚基在低亲和和高亲和构象之间转换。在β亚基中，连接组氨酸和IF2界面的螺旋上，有两个氨基酸发生了变化，就是图中黄色标注的那两个氨基酸。在α亚基中，则没有变化。这些观察结果表明，介导血红素-氧结合位点和IF2之间变构连接的结构性质在Ancα/β中就已经存在，它早于协同性和四聚化出现的进化节点。其实，在此前就曾有报道称，许多介导Hb协同性的构象变化，如血红素的几何形状的扭曲和氧结合时组氨酸和螺旋的运动，就已存在于没有协同性且为单体的肌红蛋白中。这与研究人员提出的观点是相一致的。
出于这个观点，研究人员对存在两个IF2突变的Ancα/β2突变体的氧结合能力进行了表征。正如预测的那样，Ancα/β2虽然只能形成同源四聚体，但是与Ancα/β的氧亲和力相比，Ancα/β2对氧的亲和力确实有所下降（这表现为P50值增加了），并且具有显著统计学差异的协同性（b图中各柱形图上面的示数就是反应协同性的希尔系数）。从这我们不难看出，单获取四聚体结构就有可能改变蛋白质的氧结合能力，并且能使蛋白质协同性结合氧。然而，四聚体在高亲和力和低亲和力状态之间转换的能力对突变很敏感。Ancα/β4和Ancα/β14与Ancα可形成异源四聚体，其氧亲和力也降低了，但它们失去了在Ancα/β2中发现的协同性。一个可能的解释是这些蛋白质中额外的突变过分稳定了低亲和构象。如果是这样的话，那么从Ancα/β到协同性复合物Ancα+Ancβ中间必然有一些氨基酸替换在调整了这个平衡，从而使得蛋白可以根据氧分压情况而决定T和R构象中哪个应该出场.。当然，目前这些氨基酸的进化先后顺序是研究中还没有解决的问题: 也许IF2上的某些氨基酸替换能够立即产生具有协同效应的血红蛋白样复合物，就像Ancα/β2那样。又或者说，协同性可能是通过像Ancα/β4那样的低氧亲合力的四聚体中间产物而产生的. 至于到底哪个是真实的答案，还有待于后续的挖掘。
本研究较好的诠释了血红蛋白结构及功能的进化起源，同时，它也告诉我们，复杂的分子结构和功能并非都需要经历漫长的渐进轨迹，它也可能是因为少数一些氨基酸替换“闪亮登场”导致的结果。
Pillai AS, Chandler SA, Liu Y, Signore AV, Cortez-Romero CR, Benesch JLP, Laganowsky A, Storz JF, Hochberg GKA, Thornton JW. Origin of Complexity in Haemoglobin Evolution. Nature. 2020 May;581(7809):480-485. doi: 10.1038/s41586-020-2292-y