9000-90-2 / alpha-淀粉酶的制备方法

背景及概述^[1]

alpha-淀粉酶即α-淀粉酶，广泛存在于生物界。alpha-淀粉酶能够催化随机水解淀粉的 α‑1，4‑糖苷键，产生麦芽糖、麦芽三糖和α糊精。alpha-淀粉酶广泛应用于饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和医药等行业。

制备^[1]

（1）载体pxmj19-aph213的制备。

载体pxmj19-aph213的构建过程如下：

以引物aph213F和aph213R从载体xk99e载体上扩增出aph213基因，所用的引物如下：

aph213F：ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcac

aph213R：ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattg

PCR条件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 7min。

上述引物的设计使得aph213基因扩增过程中，在aph213基因上游形成EcoRV切点、下游形成HindIII 切点，aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；回收PCR产物并以EcoRV和HindIII酶切，通过T4DNA连接酶，连接到同样经过EcoRV和HindIII酶切的载体pxmj-19上，获得载体pxmj19-aph213。

载体pxmj19-aph213的扩增过程如下：

a、在50ml离心管中加入3ml的LB培养基，加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素；

b、挑取带有载体pxmj19-aph213的大肠杆菌DH5α转接至上述培养基中，在37℃，230rpm的条件下培养12h，以扩增pxmj19-aph213质粒；

c、根据质粒提取试剂盒的说明书提取pxmj19-aph213质粒。

（2）枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因的扩增与改造。

以引物AmyF和AmyR从枯草芽孢杆菌的基因组上扩增出α-淀粉酶基因，所用的引物如下：

AmyR：ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag；

AmyF：ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc；

PCR条件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃7min。

上述引物的设计使得α-淀粉酶基因扩增过程中，在α-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列、下游形成组氨酸标签，上游酶切位点为HindIII，下游酶切位点为XhoI；

（3）构建重组载体。

回收PCR产物并用XhoI和HindIII酶切，通过T4DNA连接酶，连接到同样经过XhoI和HindIII酶切的载体pxmj19-aph213上，获得重组表达载体pxmj19-aph213-amy。

（4）构建重组菌。

将重组表达载体pxmj19-aph213-amy转入大肠杆菌中进行预扩增，培养基为LB培养基，氯霉素浓度为50ug/ml；提取后，用电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌中，在LBHIS恢复培养基中30℃培养，氯霉素浓度为30ug/ml。

（5）培养重组菌，分泌表达α-淀粉酶。

将长出的转化子转接到装有50ml培养基的250ml的三角瓶中进行培养，培养基为BHI培养基，培养条件为30℃，230rpm，48h。

（6）α-淀粉酶的纯化。

a、将重组菌的培养物进行离心，12000rpm、4℃、5min，获得含有α-淀粉酶的上清。

b、将含有α-淀粉酶的上清进行亲和层析，首先用缓冲液A平衡镍柱，将含有α-淀粉酶的上清过滤并上样至平衡后的镍柱，继续用缓冲液A平衡至基线水平后继续平衡3个柱体积；用100mmol的B液洗脱，收集洗脱的洗脱液，每管收集0.5ml；

缓冲液A为：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的缓冲液，缓冲液B为：300mM NaCl，250mM 咪唑，20mM Tris，pH8.0的缓冲液。

c、对含有α-淀粉酶的洗脱液通过脱盐柱进行脱盐，获得纯化的α-淀粉酶溶液，-20℃保存；

脱盐用的缓冲液为50mM的PBS缓冲液，pH为7.0。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201610836135.0 α-淀粉酶的制备方法【公开】/α-淀粉酶的制备方法【授权】