76-03-9/三氯乙酸沉淀蛋白的原理及方法

三氯乙酸又名三氯醋酸，易潮解 ，溶于水、乙醇、乙醚 ，主要用于有机合成和制医药、化学试剂、杀虫剂。实验中常常需要用三氯乙酸来沉淀蛋白，那么它的原理是什么？如何操作的呢？

三氯乙酸沉淀蛋白原理

① 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐；

② 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团, 使之聚集沉淀；

③ 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显；

④ 电泳图谱显示，BSA、HSA 单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于TCA 的结合，使SDS 与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致。

三氯乙酸沉淀蛋白方法

1)加1/4体积的 TCA+DOC于蛋白质组分（置1.5-ml聚丙烯微量离心管中），至TCA的终浓度为20%(w/v)。震荡混合。

2)冰上解育20~30 min。

3)微型离心机，室温离心15 min。沉淀物如可见，为粘稠的带黄褐色的胶状物。用一精细的巴氏吸管吸出上清。努力除去尽可能多的上清。如取100ul样品进行沉淀，沉淀物将是可见的。

4)加3倍体积（原样品体积的丙酮（室温)。样品在室温下静置约10 min, 使TCA+DOC溶于丙酮。

5)室温离心15 min。其时，沉淀物的大小和物理特性类似于一点灰尘。约10ug或更多一点的蛋白质即可看见。有时，会得到白色的盐类（如KCl等）沉淀物。用极精细的巴氏吸管移去上清。沉淀物置冰上干燥10 min(敞开1.5-ml离心管的盖)。干燥的沉淀物可长时间（>1 个月）地保存于-20℃。

6) 用含 2-巯基乙醇的样品缓冲液（lx)(对于标准的小型平板凝胶装置，用 6ul) 溶解沉淀物。如仍有少量的TCA 残留物，溴酚蓝将转呈黄色。这无关紧要，因为电泳时有足够的缓冲能力来中和痕量 TCA。如沉淀物中有残留的 KCl, 将样品缓冲液加于沉淀的蛋白质时，将会形成絮状的白色沉淀（十二烷基硫酸钾）。如十二烷基硫酸钾发生沉淀，就很难将样品加于 SDS 凝胶，但样品一旦加到凝胶上，电泳将会很好地进行。

7) 若需分子量标准参照物，则可用不含 2-巯基乙醇的 lxSDS 样品缓冲液将蛋白质分子量（MW) 标准配制成每毫升含 0.5 mg 总蛋白的储液。分成小等分试样 (50ul) 储存于-20℃。对于银染，可取 2ul 分子量标准+4ul 含 2-巯基乙醇的样品缓冲液，至终体积为6ul。

来源：元素商城