67604-48-2 / 应用酿酒酵母高效合成柚皮素

柚皮素是一种典型的黄酮类化合物，具有多种保健功效，例如抗肥胖症、抗糖尿病、抗高血脂、高血压等。从植物中提取是柚皮素的重要来源，但是植物提取法受季节性影响和产地影响较大，而微生物法合成具有多重优势，例如生产强度高、反应条件温和、可以利用廉价碳源等，因此微生物法合成柚皮素具有巨大潜力。

图1 在酿酒酵母中高效合成柚皮素策略

酿酒酵母具有生物量高、生长迅速、遗传背景清晰、改造技术成熟等优点，可作为优良的柚皮素生产宿主。在酿酒酵母中从头合成柚皮素需要依次外源导入四个基因，分别是酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase，TAL)，4-羟基肉桂酰辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamoyl-CoAligase，4CL)，查尔酮合酶(chalconesynthase，CHS)和查尔酮异构酶(chalconeisomerase，CHI)。酿酒酵母本身具有经莽草酸途径合成酪氨酸的能力，以酪氨酸为前体，经过上述四个外源基因的催化合成柚皮素。但是在酿酒酵母中异源合成柚皮素，限速步骤依然未能探索清楚，这限制了在酿酒酵母中高效合成柚皮素及下游衍产物。

图2 用于鉴定限速步骤的菌株基因型

本研究首先将四个外源基因整合在酿酒酵母基因组上，构建了一株可以从头合成柚皮素的菌株。以此菌株作为平台，验证在酿酒酵母合成柚皮素的限制步骤。首先在平台菌株上整合表达莽草酸途径的抗反馈抑制基因ARO4K229L(3-deoxy-7-phosphoheptulonatesynthase，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶)、ARO7G141S(chorismate mutase，分支酸变位酶)、来自于大肠杆菌的莽草酸激酶ecoaroL(shikimate kinase)，通过强化莽草酸途径鉴定出莽草酸途径代谢通量低是合成柚皮素的第一个限速步骤。然后再分别单独过表达四个外源基因，验证四个外源基因对柚皮素合成的影响，鉴定出CHS活性低是合成柚皮素的第二个限速步骤。在鉴定限速步骤后，通过添加不同的前体确定对第一个限速步骤的解除程度，验证了直接添加对香豆酸可以最大程度解除第一个限速步骤。然后从水飞蓟中分离鉴定了一个高酶活的SmCHS，并过表达，以此解除第二个限速步骤。经过发酵优化，可以在5-L发酵罐水平积累648.63 mg/L的柚皮素。

图3 不同菌株的柚皮素积累量

研究工作得到了国家重点研究发展计划（2017YFC1600403），国家优秀青年科学基金（21822806），国家自然科学基金（31670095、31770097）等项目的资助，以“Efficientbiosynthesis of (2S)-naringenin from p-coumaric acid in Saccharomycescerevisiae”发表在期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry上（Gao et al., J. Agric. Food Chem. 2020, 68, 1015−1021）。博士生高松为论文第一作者，陈坚教授和周景文教授为通讯作者。

图4 最佳菌株在5-L发酵罐水平发酵优化