634-01-5 / 腺苷-2′,3′-环磷酸的制备方法

背景及概述^[1]

环形核苷酸是细胞内重要的第二信使，参与细胞内多种信号转导途径的调控。现已知发现的第二信使包括环形腺苷单磷酸(3′,5′-cAMP)、环形鸟苷单磷酸(3′,5′-cGMP)、环形胞苷单磷酸(3′,5′-cCMP)、环形尿苷单磷酸(3′,5′-cUMP)、环形二鸟苷酸(c-di-GMP)，环形二腺苷酸(c-di-AMP)及环形鸟苷腺苷酸(cGAMP)。除了上述已发现的环形核苷酸类第二信使外，在2009年埃德温(Edwin)等人还首次在人的肾脏细胞中发现了腺苷-2',3'-环磷酸(2′,3′-cAMP)，随后人们又在哺乳动物的大脑等组织细胞中发现了腺苷-2',3'-环磷酸的存在。科研人员还从植物细胞中检测到腺苷-2',3'-环形单磷酸和鸟苷-2',3'-环磷酸(2′,3′-cGMP)，从一株荧光假单胞菌中检测到胞苷-2',3'-环磷酸(2′,3′-cCMP)和尿苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cUMP)的存在。现有的研究结果表明，这四种2′,3′-环形核苷单磷酸很可能代表了另外一类新型的生物细胞第二信使。由于2′,3′-环形核苷单磷酸吸引了越来越多的关注，其在科学研究和医学上的需求也日益增多。目前2′,3′-环形核苷单磷酸的制备均采用化学合成的方法，尚未有生物制备方法。化学合成法生产2′,3′-环形核苷单磷酸，产量低，价格高，在一定程度上限制了其开发应用。

制备^[1]

步骤1：2′,3′-环形核苷单磷酸混合物的提取

(1)将洗脱得到的目的蛋白LfliZ，0℃静置3d，此时蛋白溶液将会出现明显的沉淀。将蛋白溶液12000rpm离心20min，得到上清液；

(2)将步骤(1)中得到的上清液，用截留分子量为3K的超滤管超滤，去除残留的蛋白，超滤膜滤过液即为含有4种2′,3′-环形核苷单磷酸溶液；

步骤2：四种环形核苷酸腺苷-2',3'-环磷酸，2′,3′-cGMP，2′,3′-cCMP和2′,3′-cUMP纯品的提取

(1)将得到的2′,3′-环形核苷单磷酸溶液，采用C18反向色谱柱进行高效液相色谱分离得到四种2′,3′-环形核苷单磷酸纯品；所用的流动相为：A液，10mM醋酸铵溶液，pH5.0；B液，75％A液加入25％甲醇；

(2)上述步骤中所用的分离程序为：0min，B液0％；2.5min，B液0％；5min，B液30％；10min，B液60％；14min，B液100％；21min，B液100％；22min，B液50％；23min，B液0％；30min，B液0％。流速为10mL/min，检测波长为254nm。

步骤3：四种纯品2',3'-环形核苷单磷酸产量检测

(1)将购买的4种2′,3′-环形核苷单磷酸标准品用蒸馏水稀释到如下浓度梯度：0μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，采用C18反向色谱柱进行高效液相色谱检测各浓度的环形核苷单磷酸标准品所对应的峰面积，之后以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线。

(2)利用做好的标准曲线，将制备好的4种2′,3′-环形核苷单磷酸样品用C18反向色谱柱进行高效液相色谱分别检测浓度可得，每升培养液可提取1.30±0.17μmol的2',3'-cCMP、1.40±0.12μmol的2',3'-cUMP、2.81±0.25μmol的2',3'-cGMP和2.61±0.19μmol的腺苷-2',3'-环磷酸。根据4种2′,3′-环形核苷单磷酸的分子量，将上述摩尔量换算成质量计算可得，每升培养液可提取约2.5mg的四种纯品2',3'-环形核苷单磷酸。

主要参考资料

[1] CN201610430027.3 一种海洋细菌基因LfliZ及应用