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烟草是双子叶植物纲（Dicotyledoneac）管花目（Tubiflorae）茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana），多为一年生草本，是我国重要的经济作物。烟草主茎的高度从十几厘米到几百厘米。单叶互生，有叶柄或无叶柄，叶形变化较大。聚伞状花序，花色有黄色、白色、紫色、红色等。管状或钟状花萼，管圆筒形花冠。5 枚雄蕊着生于花冠基部，子房三室或四室。每个蒴果约有 2000粒种子。茎、叶和花萼都有腺毛，能分泌粘液。最重要的是大多数烟草属植物能产生一种特有的生物碱，含量在 0.5 %-10 %，烟草中生物碱的组成和含量是衡量烟叶品质的重要指标之一。烟碱的生物合成，烟碱和降烟碱之间转化的调控机制，一直是烟草研究热点。研究将利用基因工程技术，进一步阐述降烟碱代谢调控的分子机制，为烟草的“降焦减害”提供理论基础。
烟碱（nicotine）是普通烟草（Nicotiana tabacum L.）中主要的生物碱，占生物碱总含量的 90 ％-95 ％，降烟碱含量通常低于生物碱的 5％。但一些白肋烟和烤烟品种在成熟和加工过程中会将烟碱转化为降烟碱，使降烟碱成为含量最高的生物碱。高温条件下降烟碱生成麦斯明（myosmine）和取代吡啶化合物，影响烟草的本来香味。此外对人体健康有危害，是潜在致癌物质亚硝基降烟碱（nitrosonornicotine，NNN）的合成前体，降烟碱本身也能直接诱导吸烟者血浆中蛋白的异常糖基化，与类固醇类药物发生共价反应，影响药效和毒性。
降烟碱是卷烟烟丝中的主要生物碱之一，对卷烟品质有重要影响，并是烟草特有亚硝胺——亚硝基降烟碱（NNN）的前体物质。降烟碱分子含有一个手性中心，所以降烟碱有两个对映体：S-(-)-降烟碱（简称S-降烟碱）和R-(+)-降烟碱（简称R-降烟碱）。根据对映异 构体的特性，降烟碱的两个对映对映体可能具有完全不同的代谢机理和生理特性。因此，有必要对卷烟烟丝中降烟碱的对映异构体含量进行分析测定。目前，文献报道降烟碱对映异构体的测定方法主要有气相色谱-质谱联用法、多维气相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等，但是，GC-MS和MDGC-MS需要 在前处理过程中进行衍生化，费时费力，CE仅使用保留时间进行定性，定性能力相对较差，容易出现假阳性结果。因此有必要开发一种灵敏度高、精密度好、适合大批量准确定量卷烟烟丝中S-降烟碱和R-降烟碱的方法。基于上述技术不足，有研究建立了一种合相色谱-串联质谱法测定卷 烟烟丝中降烟碱对映异构体含量的方法。本方法在前处理过程中不需要衍生化过程，实现了S-降烟碱和R-降烟碱的基线分离，并使用二级质谱进行定性和定量，避免出现假阳性结果，所以，本方法具有操作简便、灵敏度高、准确定好等优点。通过以下技术方案来实现的：将卷烟烟丝样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用二氯甲烷萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用串联手性柱-合相色谱-串联质谱法分析，采用峰面积归一化法定量检测卷烟烟丝中S-降烟碱和R-降烟碱的比例。具体步骤如下：
1）标准溶液的配制：称取约100.0 mg的S-(-)-降烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中， 配制成浓度约为2.0 mg/mL的S-(-)-降烟碱标准储备液；称取约100.0 mg的R-(+)-降烟碱 标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的R-(+)- 降烟碱标准储备液；利用S-(-)-降烟碱标准储备液和R-(+)-降烟碱标准储备液稀释配制S- (-)-降烟碱和R-(+)-降烟碱浓度分别为100 μg/mL和100 μg/mL的混合标准溶液
2）卷烟烟丝样品的混匀：将卷烟烟丝样品置于40 ℃烘箱中，1小时后将卷烟烟丝取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛。
3）卷烟烟丝样品的萃取：选择正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷五种溶剂进行萃取效率的比较。结果发现，二氯甲烷对降烟碱的萃取效率最高，甲基叔丁基醚和乙酸乙酯次之，正己烷和三氯甲烷的萃取效率最差，故选择二氯甲烷为最终的萃取溶剂。优化的萃取步骤为：称取0.3 g已粉碎的样品于15 mL具塞离心管中，加入2.0 mL 5%的氢氧化钠溶液（质量比），涡旋1 min混匀后静置10 min浸润样品，取10 mL二氯甲烷到离心管中，并于旋涡混合 器上以4000 rpm速度振荡30 min。
4）萃取液的净化：取1.5 mL上清液于2 mL净化离心管中（内含150 mg无水硫酸镁，50mg PSA吸附剂，25 mg GCB吸附剂，统称基质分散固相萃取材料），于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以 10000 rpm离心1 min。取上清液过0.45 μm有机相滤膜后进液相分析。
5）串联手性柱-合相色谱-串联质谱法条件：分析柱1为Trefoil CEL1柱（柱长 150 mm，内径3.0 mm，固定相粒径2.5 µm），分析柱 2为Chiralcel OD-H液相色谱柱(柱长 250 mm，内径4.6 mm，固定相粒径5 µm)；流动相A 为：CO2，流动相B：含0.05%异丙胺的甲醇；流速为1.0 mL/min；梯度洗脱条件为：0.0 min， 97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；12.0 min，92% A； 30.0 min，90% A。柱温40 ℃；进样室温度：10 ℃；进样体积2 μL；背压：1600 psi；ISM补偿流路流动相为含0.1%甲酸的甲醇，流速为0.3 mL/min。分析时间总计30 min。质谱条件：离子源：电喷雾源，扫描方式为正离子扫描，离子源温度为300 ℃，电喷雾电压为5000 V，雾化气压力为40 psi；检测方式：多反应监测（MRM）；。通过对峰面积进行归一化定量S-降烟碱和R-降烟碱占总降烟碱的比例。
6）检出限和定量限：在优化条件下，按照目标物信噪比为3时对应的浓度作为检出限，按照目标物信噪比为 10时对应的浓度作为检出限。S-降烟碱的检出限和定量限分别为0.12 μg/g和0.40 μg/g， R-降烟碱的检出限和定量限分别为0.12 μg/g和0.40 μg/g。
7）精密度：取同一卷烟烟丝样品进行5次日内和日间平行测定，考察了上述方法的精密度，结果表明，卷烟烟丝样品中S-降烟碱的日内和日间测定结果的变异系数分别为1.08%和2.45%，精密度较好。
[1] 烟草（Nicotiana tabacum L.）降烟碱代谢调控的分子机制研究
[2] CN201710698782.4一种合相色谱?串联质谱法测定卷烟烟丝中降烟碱对映异构体含量的方法