541-15-1 / 左旋肉碱的纯化方法和含量检测

背景及概述^[1]

左旋肉碱(L-carnitine)，也叫L-肉碱，音译卡尼丁，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，是乳粉中一种营养成分，因其是一种类维生素营养素，也将其命名为维生素Bt。

含量检测^[1]

1、试剂准备

高氯酸溶液(13％)：13mL高氯酸稀释至100mL。

氢氧化钠溶液(10mol/L)：称取40g氢氧化钠用水溶解，冷却后稀释至100mL。

氢氧化钾溶液(4.0mol/L)：称取22.4g氢氧化钾用水溶解，冷却后稀释至100mL。

显色储备液：分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中，用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3个月。

显色工作液：吸取5.0mL显色储备液用水定容至25mL。

乙酰辅酶A(AcetylCoA)溶液：20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中。临用时配制。

乙酰肉碱转移酶(CAT)溶液：吸取10μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，经1500r/min离心10min，弃去上层清液，沉淀用0.2mL水溶解。临用时配制。

左旋肉碱标准品，sigma，纯度99％。配制成5个浓度备用，现配现用，分别是1.6，3.2，6.4，9.6，16ug/ml。

2、仪器

分析天平：万分之一。

pH计：精度0.01。

离心机：转速≥1500r/min。

恒温水浴锅：温度可控制在40℃±2℃。

酶标仪405nm及配套的96孔酶标板。

3、样品处理

准确称取2.5g混合均匀的试样于带刻度的50ml离心管中，用15mL40℃温水溶解。加入5mL13％高氯酸溶液，混合均匀后静止20min。用蒸馏水定容至刻度，混匀，用定量滤纸过滤。

取滤液20mL，用4mol/L氢氧化钾溶液调pH为12.5～13.0后，置于40℃水浴60min。冷却后用13％高氯酸调pH为7.0～7.5。将样液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀后置于4℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温，取上清液测定。

4、分析测定

在酶标板上设置标准孔5个(1.6，3.2，6.4，9.6，16)和样品孔，最好双孔平行测试；

取200ul标品或样品加入到相应的微孔中；

加入80ul底物到各个孔，加入10ul辅酶A到各个孔。轻轻混匀，立刻开始计时5分钟，室温；

在405nm读取吸光度OD1；

每孔加入10ul转移酶溶液，混匀(轻轻搅拌效果好)，计时10分钟，室温；

用酶标仪405nm测试吸光度OD2。

5、结果计算

用吸光度差(OD2-OD1)作纵坐标，浓度值为横坐标，作图，从图中读出样品浓度，乘以稀释倍数(稀释倍数50)得最终结果。

纯化方法^[2]

取100g左旋肉碱粗品于100mL添加0.1%甲酸甲酯的甲醇中，于-30℃下搅拌1小时使之混合均匀，过滤，除去不溶于该有机溶剂的沉淀物，并用贮藏于0℃下的甲醇洗涤沉淀物3次，滤液合并入左旋肉碱溶液，真空减压浓缩除去有机溶剂，即得左旋肉碱纯品。

经检测，该左旋肉碱产品化学纯度为97%。

参考文献

[1][中国发明]CN201810498612.6一种乳粉中左旋肉碱含量的检测方法

[2][中国发明]CN201510850786.0一种左旋肉碱粗品的纯化除盐方法