52705-93-8/人参皂苷Rd的制备与生物活性

背景及概述^[1]

人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，三萜皂苷，主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是人参中的活性成分，因而成为研究的目标，目前已分离鉴定出40余种人参皂苷单体。因为人参皂苷影响了多重的代谢通路，所以其效能也是复杂的，并且各种人参皂苷的效能是难以分离出来的。而对单体进行生物活性研究易于阐明其确切的药理作用，故对于人参皂苷单体化合物的研究越来越多。人参皂苷单体化合物中Rg1、Rb1、Rc等量较高，而Rd、Rg3、Rh2等属于稀有皂苷，但药理活性却优于主要人参皂苷。其中，人参皂苷Rd是主要皂苷代谢后在肠道中吸收利用的主要形式之一，对神经系统、心脑血管以及肾功能都具有良好的药理作用。

制备^[1]

一种人参皂苷Rd的提取工艺，如图1所示，包括以下步骤：

1、将含有人参皂苷Rd成分的药材(比如三七、人参、西洋参等)粉碎成50目的药粉，加2倍量85％乙醇，冷浸16h，滤过，药渣加1.8倍量85％乙醇，回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.24的浸膏，得总提取物。

2、提取总皂苷

(1)装柱：用乙醇充分湿润预先处理过的D101大孔吸附树脂，搅拌排除气泡，装柱，浸泡12h，用95％乙醇冲洗至流出液加水混合后不呈浑浊为止，继用纯化水置换其中的乙醇至无醇味，备用；

(2)上样：取总提取物，加2倍量纯化水，搅匀，缓缓加入预先处理过的D101大孔吸附树脂柱中，使全部进入柱床，静置吸附12h；

(3)洗脱：先用5L/kg硅胶纯化水洗脱，水洗脱液弃去；继用不少于纯化水用量的60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.20的清膏，得总皂苷，大孔树脂柱用5BV 95％乙醇洗脱后备用。

3、提取人参皂苷Rd粗品

(1)上柱样品制备：取总皂苷，吸附于2倍量的硅胶上，挥发至干，过60目筛，备用；

(2)装柱：取总皂苷10倍量的柱层析硅胶，用正丁醇-乙酸乙酯-水＝2﹕3﹕5的上层溶液湿法装柱，反复用洗脱剂洗脱，使硅胶充分下沉紧密；

(3)上样及洗脱：硅胶层析柱中预留一定量的洗脱液使其淹没硅胶(即保证硅胶柱内液面高于硅胶顶部，以避免因柱内干燥而出现硅胶断层而影响分离效果)，将上柱样品慢慢加入层析柱中，用正丁醇-乙酸乙酯-水＝2﹕3﹕5的上层溶液等度洗脱，分段收集，每流份收集量为1.5L/kg硅胶，经薄层色谱检查后合并人参皂苷Rd流份，68℃减压回收溶剂至干，得人参皂苷Rd粗品。

4、纯化人参皂苷Rd

(1)上柱样品制备：取人参皂苷Rd粗品，按2.5mL甲醇/g人参皂苷Rd粗品的比例用甲醇溶解后，加入甲醇体积1/3的纯化水，搅匀，备用；

(2)装柱：按1kg硅胶/30g人参皂苷Rd粗品的比例称取反相层析硅胶Rp-C18，用甲醇湿法装柱；

(3)上样及洗脱：将上柱样品湿法上柱，用甲醇-水＝75﹕25等度洗脱，分段收集，每流份收集量为0.5L/kg硅胶，经薄层色谱检查后合并所需组分，78℃减压回收溶剂至上柱样品体积的1.8倍，静置16h，析出沉淀，上层液返回反相层析硅胶柱分离，沉淀于40℃真空干燥，得人参皂苷Rd，反相层析柱用6L甲醇洗脱后备用。

生物活性研究^[2-4]

张佳舒等人通过人参皂苷Rd处理HEK293T细胞后,组蛋白H3K9ac、H3K18ac表达水平降低,但催化修饰这2个位点的P300没有明显变化;同时人参皂苷Rd可上调HDAC2的转录和表达水平,si HDAC2处理HEK293T细胞后,逆转了人参皂苷Rd对H3K9ac、H3K18ac的下调作用。结论人参皂苷Rd通过上调HDAC2,下调组蛋白H3K9和H3K18位赖氨酸位点的乙酰化水平,从而影响下游基因的转录激活。

黄海云报道了人参皂苷Rd对乳腺增生有较好的治疗作用,其治疗作用机制可能与改善乳腺增生大鼠的微循环、调节雌激素和孕激素及对应受体的表达有关。

高进贤等人报道了人参皂苷Rd对冰醋酸所致的扭体及福尔马林所致的舔足反应均有抑制作用（P<0.05）;给予CaCl₂和Ver后, 人参皂苷Rd的镇痛作用被CaCl₂拮抗,被Ver加强（P<0.01）; 人参皂苷Rd可明显减少小鼠脊髓背角、大脑皮层和丘脑PKCγ免疫阳性细胞（P<0.01）。结论: 人参皂苷Rd的镇痛作用涉及外周和中枢,Ca²⁺与PKCγ参与了人参皂苷Rd的镇痛作用。

主要参考资料

[1] CN201510001503.5一种人参皂苷Rd的提取工艺

[2] 张佳舒,孟雪,赵书涵,邱智东,刘达.人参皂苷Rd对组蛋白H3乙酰化的调控机制研究[J].中草药,2018,49(12):2931-2936.

[3] 黄海云,高进贤,孙全武,郝荣亮,时荣,朱菊花,刘波.人参皂苷Rd对大鼠乳腺增生的治疗作用[J].兰州大学学报(医学版),2017,43(06):47-52.

[4] 高进贤,张秀娟,石磊,孙全武,黄海云.人参皂苷Rd镇痛作用与中枢PKCγ相关机制研究[J].西部中医药,2017,30(09):30-34.