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茶叶中的儿茶素主要为表型儿茶素,即表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表没食子儿茶素EGC、表儿茶素没食子酸酯ECG、表儿茶素EC,它们约占儿茶素总量的60~80%。其中EGCG是绿茶茶多酚中含量最高的物质,也是目前公认的茶叶中最主要的抗氧化成分。然而现有研究已经证实,表型儿茶素的异构体如没食子儿茶素没食子酸酯GCG等在某些方面表现出较强的生理活性,如抗氧化和清除自由基活性等。儿茶素单体化合物主要是从茶叶或茶叶提取物中进行提取,常用的分离纯化方法有液液萃取、柱层析、中低压柱色谱、高压制备液相色谱和高速逆流色谱分离等。儿茶素的分离纯化不乏其他方法,也常常采用两种或多种方法联合使用。文献及专利中常见表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表儿茶素没食子酸酯ECG等的分离纯化报道,但制备没食子儿茶素没食子酸酯GCG单体化合物的方法较少。
公开专利采用柱层析的方法纯化制备单体儿茶素,如没食子儿茶素没食子酸酯GCG,但茶叶中没食子儿茶素没食子酸酯GCG含量较低,该方法提取效率不高。公开专利以儿茶素单体化合物为原料,经高温加压热转化和凝胶介质分离等过程制备非表型儿茶素。如以表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG为原料,得到纯度99.1%的没食子儿茶素没食子酸酯GCG单体化合物,但该方法所用原料成本高;同时,在转化过程中加入钠盐或钾盐的碱金属,引入了无机盐等杂质,且采用凝胶分离纯化的方法,所制备的单体化合物纯度较低。鉴于没食子儿茶素没食子酸酯GCG良好的营养保健和生理药理作用,在茶叶及茶叶相关制品的质量控制、生产工艺的优化及其基础功效学的研究过程中,需要高纯度的没食子儿茶素没食子酸酯GCG单体化合物。
高纯度没食子儿茶素没食子酸酯GCG单体化合物的制备如下:称取30g绿茶茶多酚(总儿茶素含量>98%,咖啡因含量<0.05%)样品,加1000mL超纯水搅拌超声溶解,置于密闭容器于130 ̊C烘箱高温转化120min。取适量高温转化液,用0.22μm微孔滤膜过滤,进行快速制备液相色谱分离。快速制备液相色谱柱为C18型填料,填料质量为120g,粒径为20~40μm。分离条件为:流动相A:甲醇,流动相B:含0.1%(体积比)乙酸的水溶液;流速:50mL/min;梯度洗脱:15%A(0min)–20%A(5min)–25%A(10min)–30%A(25min)–35%A(30min)–50%A(40min);上样量:3mL;检测波长:278nm。收集23.5~25.8min的没食子儿茶素没食子酸酯GCG馏分,采用高效液相色谱法检测馏分纯度,为90.12%。多次进样,收集合并没食子儿茶素没食子酸酯GCG馏分,于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收,浓缩液再经过冷冻干燥,制得没食子儿茶素没食子酸酯GCG单体化合物粗品。
称取适量没食子儿茶素没食子酸酯GCG单体化合物粗品,用25%(体积比)甲醇水溶液稀释,配制浓度为40mg/mL的溶液,进行高压制备液相色谱分离。高压制备液相色谱分离条件为:色谱柱:C18,10μm,21.5*250mm;流动相A:甲醇;流动相B:含0.1%(体积比)乙酸的水溶液;等度洗脱:25%A;流速:25mL/min;上样量:2mL;检测波长:278nm。没收集并合并没食子儿茶素没食子酸酯GCG馏分,采用高效液相色谱法检测馏分纯度,为99.52%。没食子儿茶素没食子酸酯GCG馏分于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收,浓缩液再经过冷冻干燥和真空干燥,制得没食子儿茶素没食子酸酯GCG高纯单体化合物。对上述制备的没食子儿茶素没食子酸酯GCG高纯单体化合物,再次进行高效液相色谱纯度检测,为99.51%。
[1] CN201610129512.7一种制备高纯度没食子儿茶素没食子酸酯GCG的方法