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蛋白酶K来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber），是一种与枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶。由于它能降解角蛋白（keratin），因此被命名为蛋白酶K。它是一种高活性的广谱蛋白酶，在变性剂尿素或十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）溶液中依然能保持较高酶活力，所以被广泛应用于各种生物材料中的DNA或RNA的提取。
蛋白酶K由一条肽链组成，包含277个氨基酸残基，相对分子质量为28 930。活性部位由D39、H69和S224组成，底物识别位点主要为G100-Y104和S132-G136两个片段。蛋白酶K的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌蛋白酶具有高度同源性，因此被划分为枯草芽孢杆菌蛋白酶类。蛋白酶K包含两个二硫键（C34-C124，C179-C248），两个色氨酸残基（W8，W212）和一个游离半胱氨酸（C73）。X射线晶体学研究表明，蛋白酶K的三维结构为一个明确的球形折叠。蛋白酶K属于α/ β类蛋白质，包含6个α-螺旋，15个β-折叠和一个3/ 10螺旋。
蛋白酶K在295 nm处被激发，它的荧光性由两个色氨酸残基W8和W212决定。但是，两个色氨酸的光反应活性表现不同，W212要活泼得多。在pH 3～9范围内，色氨酸荧光量子产率恒定。对已激发的色氨酸进行热力灭活时，活化能需达到54 kJ/mol。这个值大幅地高于来自微生物的其他蛋白酶，因此可用来解释蛋白酶K较高的热稳定性。
蛋白酶K具有很高的切割活性，底物识别位点能和底物组成一个3股的反平行β片层，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。α-螺旋是保持蛋白酶K活性中心构象稳定性的主要结构。α-螺旋共包含90个氨基酸残基，占残基总数的1/3，大部分残基处在伸展的β-折叠结构中。这使得整个分子有序度低，变性熵不大，比变性焓值极低，反映了酶稳定性的本质。分子中两个二硫键及两个Ca2+也对三级结构的热稳定性有贡献。pH、温度、Ca2+、激活剂和抑制剂等是影响蛋白酶K活力的主要因素。
蛋白酶K可用于各种蛋白质的消化，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K在提取核酸中的应用涉及到食源性疾病预防、农业病虫害的防治、法医学基因鉴定比对和分子生物学试验研究等多个领域。应用对象包括原核生物、人体血样及组织、动植物组织、寄生虫、微生物等类别。蛋白酶K的应用条件，如工作浓度、缓冲液种类及浓度、处理时间、处理温度等条件依据样品的不同而变化。