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【概述】[1]
甘草酸( Glycyrrhizin，GL) 不仅是甘草中的主要药效成分，也是目前传统中草药甘草的重点研究方向。有研究表明，甘草酸( Glycyrrhizin，GL) 具有一定的抗炎、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤、解毒等方面的作用。单葡萄糖醛酸甘草次酸( GAMG) 作为甘草酸的衍生物，只含有一分子葡萄糖醛酸，其极性介于甘草酸和甘草次酸之间，能顺利进入细胞，在机体内的溶解度和跨膜转运能力比甘草酸和甘草次酸强。因而有更好的生物利用度。近20年内，部分外国学者对GAMG的抗炎、抗过敏、抗癌等生理活性进行一系列的实验研究，并对其抗癌功效的作用机制进行了初步的探索，证实了18αGAMG 和18β-GAMG都有较强的抗癌作用。因此，开发GAMG作为一种高效新药具有广阔的应用前景。同时，GAMG作为一种较为安全的新型高倍甜味剂，在食品添加剂方面的应用前景广阔。
通过化学水解法制备 GAMG 时， 其对 β-1，2 糖苷键和β-1，3糖苷键的选择性很低， 因此， 采用高能耗和高污染的化学法制备 GAMG 会生成大量的副产物甘草次酸。微生物法以其污染小、 成本低、 产率高、 副产物少等优势而得到更多研究者的青睐。我国对葡萄糖醛酸基甘草次酸的研究始于 20世纪中期，陆丁强等从鸭肝中筛选了葡萄糖醛酸苷酶能有效的将甘草酸水解生成产 物 GAMG， 李春等筛到一株紫青霉属的微生物能定向的从甘草酸开始，去掉一分子葡萄糖醛酸生成 GAMG， 并对其发酵条件进行优化，摩尔转化率达到80% 以上， 酶活为181.53 U /mL。但这些菌株的获得量较少， 工业化生产 GAMG 存在一定的困难。
【制备方法】[1]
由于 GAMG 的制备工艺比较困难， 从而限制了其 应 用。自 主 筛 选 出 能将GL特异性水解生产GAMG 的新的微生物菌株具有重要的意义。通过常压室温等离子体( ARTP) 诱变后， 筛选得到一株可水解GL生产GAMG 的蓝状真菌属的有效菌株，且产率较高， 基本上无副产物生成。这不仅为工业化生产 GAMG 提供了一个新方向， 也简化工艺并降低生产成本， 为后续的放大实验及商业化生产提供新思路， 为后续将 GAMG 应用于食品、 医药、 化妆品等工业领域奠定坚实的基础
1 菌株的筛选方法
1.1 富集培养 取 10.0 g 土样溶于 10 mL 无菌水中充分混匀后， 接种 到 100 mL 富 集 培 养 基 中，30 ℃、 160 r /min 的摇床中培养 36 h。
1.2平板初筛 将富集液进行无菌水梯度稀释后，取1×10-5、 1 × 10-6、 1 × 10-7 三个稀释梯度 100 μL稀释液均匀涂布于选择培养基平板上，28～30 ℃ 培养3 d，挑出在此平板上长出的单菌，并进行分离纯化。
1.3 摇瓶复筛 平板初筛的单菌株活化后， 以10% 的接种量接入发酵培养基中， 28 ℃、 160 r /min进行摇瓶培养，8000 r /min 离心 15 min 后取发酵上清液进行酶活测定， 检测上述平板长出的菌株是否为 GAMG 产生菌，依据酶活高低筛选出产 GAMG 的菌株。
2 β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-GUS) 活力的测定方法
移取 200 μL 粗酶液加入到 800 μL 含有甘草酸浓度2 mg /mL、 pH5.0 的醋酸－醋酸钠缓冲溶液中，40 ℃ 条件下反应 1 h 后，沸水浴中使酶失活， 取反应液样品过膜后在 HPLC 上检测 GAMG 的含量。β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力定义为在上述条件下，每小时生成1 μg的 GAMG 所需要的酶量为一个活力单位( U /mL) 。
3 常温室压等离子体诱变( AＲTP) 选育高产菌株
取活化好的有效菌株斜面， 用无菌生理盐水洗下孢子， 采用无菌双层擦镜纸过滤， 即得单孢子悬液，涂布于金属载片的表面上， 采用氦气为工作气体，设置处理功率为 120 W， 处理距离为 2 mm， 气流量为 10 SLM， 对菌株进行诱变， 处理时间为 30、 60、90、 120、 150、 180、 210、 240 s。选择合适的菌落平板进行计数来计算致死率，并绘制出致死曲线。同时挑取平板上的菌落进行发酵测定酶活。致死率计算公式:致死率( % ) = ( U－T) /U × 100， 其中 U 为不经诱变处理生长的菌落数，T 为经诱变处理后生长的菌落数。
4 突 变 株 的 稳 定 性 实 验
将 所 筛 选 的 高 产β－GUS的突变菌株接入 PDA 培养基中， 连续传代 10次，测定每次传代后菌株发酵后的 β－ GUS 活性， 观察其遗传稳定性。
5 甘草酸和单葡萄糖醛酸甘草次酸的检测方法
5.1 高效液相色谱( HPLC)
取发酵液上清用甲醇稀释 10 倍后， 采用高效液相色谱( HPLC) 进行测定。HPLC 检测条件: 色谱柱: Agilent 的 C18 反相色谱柱( 4.6 mm × 250 mm) ，乙腈和 0.1% 的甲酸水为流动相， 流速为1.0 mL /min， 柱温为25 ℃ ， 进 样 量 为10 μL，紫外检测器，检测波长 254 nm。标准曲线的制作: 称取 10 mg 在105 ℃ 中干燥至恒重的 GAMG 标准品至烧杯中， 加入少量甲醇至10 mL容量瓶中定容，得到 1.0 mg /mL 的标准品溶液。将其分别稀释为 20、 40、 60、 80、 100μg /mL浓度的标准品溶液，经 0.22 μm 滤膜过滤，取样 10 μL 进行 HPLC检测， 以 峰 面 积 ( mAU) 为 纵 坐 标， GAMG 的 浓 度( μg /mL) 为横坐标， 绘制标准曲线， 其线性回归方程为: y =7.4898x－77.1828，R2=0.9957，表明相关性良好。
5.2 液质联用( LC－MS)
将发酵液样品用甲醇进行适当稀释过膜后， 采用电喷雾电离源， 负离子模式。通过 WATERS MALDI SYNAPT Q－TOF MS 对样品进行测定。
5.3 红外吸收光谱的测定
在半制备高效液相色谱上，进样 100 μL 上清液， 收集相应的产物样品，减压蒸馏， 冷冻干燥，将得到的样品在 NICOLET IS5型红外光谱仪上用 KBr 压片法进行测定。
5.4 核磁共振( NMR) 将半制备高效液相色谱
上收集 所 得 的 产 物 样 品 和 GAMG 标 品 分 别 溶 于500 μL的氘代甲醇中， 采用 AVANCE III 400 型核磁共振仪在 25 ℃下进行测定。
【鉴定】[1]
将 ARTP 诱变后酶活提高明显的目的菌株 G39，通过 LC－MS、 FT－IR、 NMR的测定技术对该菌株发酵液的主要代谢产物进行物质鉴定以检测所筛选的菌株对甘草酸的转化结果。
1 质谱表征
取发酵上清样品进行液质联用的测定，采用电喷雾电离源， 负离子模式。电喷雾是一种软电离源，通常很少或没有碎片， 谱图中只有准分子离子，因而只能提供未知化合物的分子量信息， 不能提供结构信息。由图 3 可知，保留时间为 1.67 min的物质 A 的分子量为 822， 其为甘草酸， 保留时间为2.49 min 的物质 B 的分子量为 646， 为发酵的主产物GAMG。亦没有副产物甘草次酸的生成。
2 红外表征
样品经预处理后， 其 FT-IR图谱如图 4 所示，分析可知，750 cm-1 和 1375 cm-1附近为有 C－H 吸收峰，1630～1680 cm-1 附近有 C = O 吸收峰，2420 cm -1和 3450 cm -1附近有 O－H 吸收峰， 这与GAMG 中存在的吸收峰类型相符。
3 核磁共振
样品的核磁信息如图 5 所示，δH( 400 MHz, MeOD) 5.47 ( 1H,s),4.28 ( 1H,d,J 7.7),1.32( 3H,s),1.07( 3H,s),1.04( 6H,s),0.97( 3H,s),0.78( 3H,s),0.74 ( 3H,s) 。
GAMG 标品的核磁信息为δH( 400 MHz,MeOD) 5.48 ( 1H,s) ,4.28 ( 1H, d， J7.8),1.32 ( 3H,s) ,1.07 ( 3H,s),1.05 ( 3H,s),1.04( 3H,s),0.97( 3H,s),0.78( 3H,s), 0.74( 3H,s) 。这些分子结构及反应特征的图谱表明， 发酵生产所制备的主产物为 GAMG。
【参考资料】
[1]郭立纯,赵伟.产单葡萄糖醛酸甘草次酸菌株的筛选及发酵条件的优化[J].食品工业科技,2017,38(16):88-94.