2768-90-3/胰岛素原的复性与纯化

概述^[1][2]

胰岛素原具有与胰岛素相同的生物学作用，但其生理活性比胰岛素弱，只有胰岛素的3%～5%。然而，胰岛素原的半寿期较长，约17.2分钟，注入人体后的生物活性比胰岛素持久。

胰岛素原是胰岛素的前身物，其分子结构为一条86个氨基酸残基组成的直链多肽。在生理情况下，胰岛素原分泌很少，占胰岛素样物质总量的5%～10%，但由于胰岛素原的代谢清除率低于胰岛素，前者为18～20min，而后者则为10～12min，故周围血中胰岛素原在胰岛素样活性物质中所占的比例略高于其实际比例，为10%～15%。

制备^[3]

重组人胰岛素原的制备

将Streamline Q XL灌注扩张床层析柱(Streamline 100层析柱，GE)，用流动相Ⅰ(10mM Tris‑HCl，pH9.0)平衡，从扩张床底部向上进液，流速调整为200cm/h，使扩 张床树脂扩张到固定床体积的1倍，平衡约3个柱体积；

开始上样含重组人胰岛素原的大肠杆菌表达包涵体复性液50L，从扩张床底部向上进液，调整上样流速为1000cm/h。使扩张床树脂扩张到固定床体积的5倍；

上样完毕，用流动相Ⅱ(10mM Tris‑HCl，pH9.0，0.5M NaCl)洗涤，从扩张床底部 向上进液，流速调整为1000cm/h，使扩张床树脂扩张到固定床体积的5倍，洗涤约10个 柱体积；

洗涤完毕，停泵，使树脂自然沉降，然后将柱顶下降至树脂表面并压紧树脂，从扩张 床顶部向下进液，流速调整为50cm/h，用流动相Ⅱ(10mM Tris‑HCl，pH9.0，0.5M NaCl)： 流动相Ⅲ(10mM Tris‑HCl，pH9.0，1.0M NaCl)开始梯度洗脱，梯度洗脱程序为40％～100％流动相Ⅲ梯度洗脱5个柱体积，收集洗脱峰。

经检测并计算，重组人胰岛素原的收率为89.2％，纯度为91.3％。

复性与纯化^[4]

（1）重组人胰岛素原变性抽提液的准备

用E.coli作为宿主细胞表达重组人胰岛素原(rhPI)蛋白，再将发酵菌液经离心、细胞破碎和分别用缓冲液Ｉ（20 mmol/L PBS，1 mmol/L EDTA，pH 7.4）和II（2.0 mol/L脲，1 mmol/L EDTA，1.0 mol/L NaCl，20 mmol/L PBS，pH 7.4）洗涤、并离心的粗纯化后，得到的包涵体溶于8.0mol/L脲，20 mmol/LDTT，1.0 mmol/LEDTA，pH 8.0（或6～7 mol/L盐酸胍，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0）的变性剂中，变性抽提液浓度为9.92 mg/mL，rhPI纯度为65.7 %以上，电泳见图1中条带3。

（2）高效体积排阻色谱复性与纯化重组人胰岛素原

用流动相A（20 mmol/ LPBS，4.0mol/L 脲，pH6.5）平衡 HPSEC柱(TSK gel G2000SWXL，300 ×7.8 mm I.D.)，变性抽提液直接进样200 μL，在流速0.3 mL/min下进行30 min的线性梯度洗脱, 直至流动相B（20 mmol/L PBS，pH 6.5）为100%, 延长10 min。rhPI质量回收率为42.5%，纯度达到95%以上，色谱图见图2（A）的曲线3，质量回收率见图2（B）中。

（3）用脱盐色谱柱二次纯化重组人胰岛素原

用0‑10 mmol/LPBS，pH6.0‑7.0的流动相平衡的脱盐色谱柱（HiTrap Desalting column），对复性与纯化得到的含人胰岛素原的色谱馏分I直接进样，持续洗脱30 min，流速1.0ml/min。rhPI的纯度达到了99%以上。见图1中条带5。

主要参考资料

[1] 协和医学词典

[2] 内科学·第二卷

[3] [中国发明,中国发明授权] CN201110406282.1 一种制备重组人胰岛素原的方法

[4] [中国发明] CN201310065815.3 重组人胰岛素原的复性与纯化方法