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作为萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase )的作用底物，常常用于以下实验，
1）体内活体成像In vivo imaging ;荧光素酶标记的肿瘤细胞、干细胞或传染疾病通常注射入研究动物模型比如大小鼠内进行研究，从而对动物模型进行实时和非侵略性的监测疾病进程和/或药效。
2）体外研究In vitro study，包括荧光素酶和ATP水平分析﹔报告基因分析﹔高通量测序和各种污染检测。
作用机制:在ATP和荧光素酶的作用下，D-荧光素（底物）被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性(见下图)。
机理阐释（体内）:荧光素酶( Luc ) 催化底物D-荧光素，利用ATP和Mg2+作为辅因子，氧气存在下发射一典型的黄绿光，之后在体内37°C下迁移到红光。
机理阐释（体外)∶很多因素都可能影响反应灵敏性，包括温度、pH或底物浓度。建议使用pH 7.8的缓冲液，并且使用前将所有试剂预热到室温。建议反应缓冲液内添加过量的ATP和Mg2+以达到最佳反应状态。
D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍应用于整个生物技术领域，尤其是体内活体成像技术。
将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大、小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。