手机扫码访问本站
微信咨询
偶氮胭脂红 G 是一种酸性三苯甲烷类染料。
一、偶氮胭脂红G分光光度法测定蛋白质
在酸性介质中，偶氮胭脂红 G与蛋白质在室温下能迅速结合并导致体系的吸收光谱发生明显改变。王琳琳等基于此结合反应建立了一个测定蛋白质的光度分析新法。
1、实验方法： 在 10 m L 比色管中， 依次加入适量的蛋白质标准溶液( 在条件实验中均加入 BSA作为标准蛋白)或样品溶液，2 . 0 ×10-4 mol/ L的偶氮胭脂红 G 溶液 1.0 mL 和 1.0 mol/L 的 H2SO4溶液2.0 mL，用水稀释至刻度并摇匀，在室温下以相应的试剂空白为参比， 用 1 cm 比色皿，在波长570 nm 处即时测定吸光度.
2 结果与讨论
2.1吸收光谱 在酸性介质中，偶氮胭脂红 G 溶液为粉红色，加入蛋白质后 ，溶液由粉红色变为紫红色，其吸收曲线如图 1 所示。可见，在偶氮胭脂红G 的试剂空白中加入牛血清蛋白质后，导致试剂空白的吸收峰位由 520 nm 红移至 570 nm，表明偶氮胭脂红G 与 BSA 之间生成了复合物 . 实验选择570 nm 作为测定波长.
2.2反应酸度的选择 实验发现， 蛋白质与偶氮胭脂红 G 之间的结合反应只有在强酸性介质中才能发生，结合体系的最大吸光度在 pH <1. 5 时依然没有出现，于是实验采用 1.0 mol/ L的 H2SO4 直接控制体系的 pH，并试验了1.0 mol/L H2SO4 的加入量对结合体系吸光度的影响. 结果表明，1.0mol/L H2SO4 的加入量过高或过低都将导致结合体系吸光度的下降，而当 H2SO4 的加入量为 2.0mL 时，结合体系的吸光度达到最大值。因此，实验中加入 2.0 mL 1.0 mol/L 的 H2SO4 控制体系的酸度.
2.3偶氮胭脂红 G 用量的选择 在 0.5～3.5 mL范围内，优化了2.0×10-4 mol/L 偶氮胭脂红G 的用量。结果表明，随偶氮胭脂红 G 用量的增加，体系吸光度逐渐增大，但当偶氮胭脂红 G 用量的达到1.25 mL 以上时，体系放置 20 min 以上即有沉淀出现，为使体系的灵敏度最大，同时又具有一定的稳定性，实验选择偶氮胭脂红 G 溶液的用量为1.0 m L .
2.4反应温度、时间、稳定性及加入顺序 在选定的酸度和染料用量条件下， BSA 与偶氮胭脂红 G之间的结合反应可在室温下迅速发生，加入试剂混合均匀后，体系的吸光度就达到了最大值并与试剂的加入顺序和放置时间(至少在 3 h 内) 基本无关，说明该体系具有快速、稳定、简单的特点.
2.5工作曲线与灵敏度 在上述选定的测定条件下，分别研究了体系在 570 nm 的吸光度与各蛋白质浓度之间的关系，得到了牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA) 和免疫球蛋白(IgG) 的工作曲线及其线性回归方程 ，并由线性回归方程的斜率计算了摩尔吸光系数及 Sandell 灵敏度， 结果列于表 1中。由表 1 的数据可见，本法对于这 3 种蛋白质的测定具有较宽的线性范围和较好的灵敏度，且对人血清蛋白和免疫球蛋白具有非常相近的响应，因此可用于血清样品中总蛋白的测定 .
2.6 共存物的影响 对多种氨基酸、金属离子及蛋白酶等对 5.0 μg/m L BSA 测定的影响进行了试验，结果见表2。可见，当允许相对误差在±5%以内时，大部分共存物的允许存在量较高，说明方法具有较好的选择性。
2.7 样品分析 将方法直接用于稀释1000 倍后的人血清样品( 云南大学校医院提供) 中总蛋白含量的测定，且在 1.0 mL 血清样品中分别加入人血清标准蛋白质进行加标回收测定，其结果见表 3。可见，用本方法测得的结果与 CBBG -250 法测得结果基本一致.
[1]王琳琳，王俊芳，张媛，丁中涛，曹秋娥.偶氮胭脂红G分光光度法测定蛋白质的研究[J].云南大学学报(自然科学版)，2008(01):83-86.