20554-84-1/小白菊内酯

【背景及概况】^[1][2][3]

小白菊内酯是一种倍半萜烯内酯类天然产物，分离自艾菊、观光木等药用植物，这些植物广泛应用于发热、驱虫和抗炎等。近年来的研究证实小白菊内酯具有多种重要的药理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗动脉粥样硬化等，小白菊内酯传统上主要用来治疗偏头痛、发热和类风湿性关节炎等。近年来研究发现小自菊内酯在多种肿瘤中发挥抗癌作用，如乳腺癌、胆管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、黑色素瘤和神经元 等，并成为研究的一个重要热点，作用机制主要为抑制核转录因子kappa B、组蛋白去乙酰化酶和白细胞介素-12等。但是小白菊内酯的水溶性较差，这也限制了它的临床研究和应用。为了提高小白菊内酯的水溶性和生物活性，人们对其结构进行了大量的修饰与改造工作，发现了一些具有优异生物活性的小白菊内酯衍生物。前期研究显示，小白菊内酯结构中a -亚甲基-7-丁内酯的Micheal加成产物能够增加分子的水溶性，并保持或提高生物活性。二甲胺衍生物LC-1是其中的一个成功实例，其具有显著的抗肿瘤和良好的理化参数，目前已进人临床研究。

【结构】^[1]

小白菊内酯分子式C₁₅H₂₀O₃，分子量248.32，CAS号20554-84-1，结构式如下：

【生物活性及应用】^[1][3][4]

倍半萜内酯类化合物小白菊内酯是从小白菊中提取的化合物，最初被用来治疗皮肤感染、风湿病以及偏头痛。近期研究表明，小白菊内酯可抑制前列腺癌、乳腺癌、胃癌、白血病癌、肾癌、肺癌、结肠腺癌、成神经管细胞瘤等癌细胞的生长，在动物模型上小白菊内酯还能治疗紫外线引起的皮肤癌。对其作用机理研究发现，小白菊内酯能抑制转录因子NF-κB的激活，其活性可能主要来源于p65/NF-κB亚基的Cys38上的巯基与含笑内酯发生了 Michael加成反应，由于NF-κB是调控肿瘤侵袭、转移、药物抗性的重要基因，抑制NF-κB的激活有可能提高肿瘤对于抑瘤剂所引起的细胞凋亡的敏感性。最近，纽约罗切斯特大学医学院的Jordan，C.T.博士及其同事发现小白菊内酯能够在基本不损伤正常干细胞的情况下，针对性地消灭引发急性和慢性骨髓性白血病的干细胞，从而有可能根本上遏制白血病复发，小白菊内酯这一独特的作用机制，已引起人们的广泛关注。其具体作用可分为以下几点：

1. 抑制先天免疫

小白菊内酯能够抑制先天免疫系统一组低聚物分子的炎症蛋白质集合体，这类蛋白质在对危险信号起反应的固有免疫细胞胞浆中形成，主要招募和激活caspase-1，使无活性的前IL-1p3和前IL-l8转换为有活性的IL-1B3和IL-18。其中NALP3尤其重要，不适当的NALP3激活与人类许多疾病的发病有关，包括痛风性关节炎、矽肺、神经退行性变等。细菌、病毒、纯化的微生物制品、小分子免疫激活剂、死亡细胞的成分、结晶体或聚集物等都可以激活NALP3。小白菊内酯能够强有力的抑制多种炎症蛋白，可直接抑制蛋白水解酶caspase-1的活性和NLRP3的三磷酸腺苷酶活性。研究证实，小白菊内酯通过烷化p20中关键半胱氨酸残基而抑制caspase-1，质谱法鉴定发现一个p20半胱氨酸残基的caspase-1上的半胱氨酸285活性中心被小白菊内酯修饰，类似推测，小白菊内酯对NL-RP3依赖的三磷酸腺苷酶活性的抑制效应也可能是由于烷化作用所导致，并不依赖于NF-KB途径 。在活体外，小白菊内酯能够抑制IgE抗原诱导的肥大细胞脱颗粒，并独立于NF-KB途径，而没有观察到小白菊内酯对FcsR1介导的早期信号转导分子多种蛋白酪氨酸磷酸化有影响，包括p38，JNK1/2，ERK1/2，和cPKCs，小白菊内酯直接干扰了肥大细胞的微导管的形成；在活体内，小白菊内酯能抑制IgE介导的被动皮肤过敏反应 。基于小白菊内酯干扰肥大细胞脱颗粒的生物特性，可能被用于研制有效的抗过敏药物。

2. 抗炎

小白菊内酯通过细胞内机制抑制IkB蛋白磷酸化和NF-KB的激活起到抗炎作用，而小白菊内酯作为强有力的NF-KB抑制剂，其抑制NF-KB中IKK复合体的精确靶点目前文献报道尚不一致。在应用与小白菊内酯有亲和作用的试验研究中，鉴定IKKJ3为其作用靶点，而另有研究提示小白菊内酯并不直接作用于IKKB或IKKc，而是NEMO 。用不同浓度的小白菊内酯直接加入细胞核提取物中并在室温下孵化1h后用P-寡核苷酸探针检测，显示在体外小白菊内酯不改变已激活的NF-KB结合DNA的能力，表明小白菊内酯只是阻止了NF-KB的活化，而不是阻止已激活的NF-KB结合DNA的能力。激活NF-KB是血管损伤的一个重要步骤，对这一过程的药理学调节作用成为开展动脉粥样硬化新疗法的主要目标，在脂多糖(LPS)刺激的血管平滑肌细胞和单核细胞，非毒性剂量的小白菊内酯能够抑制IkBa的降解，NF-KB的激活以及MCP-1的表达，而不抑制AP-1和MAP激酶 ；在apoE小鼠，小白菊内酯能够通过NF—KB抑制延缓动脉粥样硬化损伤，减少损伤区域，改变斑块成分，而不影响细胞凋亡和氧化应激过程 。在心肌缺血再灌注损伤，小白菊内酯被证实通过选择性抑制IKK的激活和IkBa降解起到保护作用 。

3. 诱导凋亡

常染色体隐性多囊肾病是由于编码跨膜受体样蛋白fi-brocystin/polyductin的PKHD1基因突变所致，缺乏FC1的肾脏细胞将会出现ERKI/2激酶活性下降，致凋亡蛋白p53上调和NF-KB激活，从而凋亡，小白菊内酯阻断IKK依赖的NF-KB的激活，减少缺乏FC1的肾脏细胞凋亡和致凋亡蛋白p53水平，为常染色体隐性多囊肾病的治疗开辟一个新的研究领域 。在人胰腺癌细胞株BxPC-3，经小白菊内酯处理后出现Bcl-2和前caspase-3蛋白下调及Bax和caspase-9蛋白上调，线粒体细胞色素C释放至胞浆，和转接分子Apaf-1结合，形成凋亡小体并激活caspase-9和caspase 3ll。在肝细胞瘤细胞(sH-J1)，小白菊内酯并不抑制Bc1-2或Bcl-X (L)蛋白，氧化应激与小白菊内酯诱导的凋亡有关，SH-J1对小白菊内酯敏感主要是由于多功能解毒酶谷胱甘肽s一转移酶的低水平表达。另有研究表明，在小白菊内酯能够通过抑制信号转导子与转录激活子3激活，诱导死亡受体的表达使肝细胞癌细胞对TNF相关的凋亡诱导配体致敏，激活caspase-9和caspase-3，从而导致凋亡 。

4. 氧化应激

1）抗氧化应激血液透析患者有诸多生化、免疫和炎症改变，并增加心血管疾病的风险。这些紊乱可能来自患者尿毒症综合征本身，也可能是由于血液透析本身诱导的应激所致。应用脂多糖刺激外周血单核细胞释放模拟血液透析诱导的应激，小白菊内酯能够抑制TNFot、IL-1B、IL-6的分泌以及cox-2的激活，从而保护白细胞免受血液透析诱导的应激损伤，无明显毒副作用 。如果小白菊内酯的衍生物能够加入透析液中，透析时通过透析膜进入血液，保护白细胞免受透析诱导的损伤，将会出现保护血液透析氧化损伤的理想化合物。

2）增强氧化应激反应 研究发现，非毒性剂量（≤5~mol/L）小白菊内酯可显著地减少Jurkat T细胞的激活诱导性细胞死亡(AICD)，小白菊内酯通过阻断NF-KB与CD95L促进剂的结合而抑制CD95(APO-1/Fas)L的表达，保护CD95介导的活性T细胞的AICD，小白菊内酯这一作用过程对NF-KB的抑制具有相对的高度特异性，而不抑制JNK、p38和AP-1，而高浓度小白菊内酯诱导Jurkat T细胞的凋亡却独立于NF-KB途径，主要是抑制细胞周期G/M停滞，不能保护T细胞的AICD 。低浓度的小白菊内酯能够通过阻止TCR信号途径减少氧化应激，在高浓度时却通过自身的氧化应激诱导活性氧导致氧化应激介导的Jurkat T细胞凋亡，增强了氧化应激，表明小白菊内酯对氧化应激有双向调控作用，这一点对小白菊内酯的临床应用将会非常重要。小白菊内酯能够诱导氧化应激介导的前B细胞白血病细胞的凋亡 、通过增强氧化应激诱导肿瘤细胞的凋亡 等支持其通过氧化应激具有抗肿瘤作用。

5. 抗肿瘤

在培养的JB6表皮细胞，损伤的AP-1、JNK、p38信号肽导致JB6细胞对中波紫外线诱导的凋亡致敏，通过致敏细胞的凋亡移除损伤的细胞意味着能够预防癌症的发生过程，而非毒性剂量的小白菊内酯明显抑制中波紫外线诱导的AP-1的DNA结合与转录活性，小白菊内酯和UVB对致敏细胞的凋亡有协同作用，并且小白菊内酯通过对AP-1和MAP激酶的抑制起到化学防癌的作用。给予小白菊内酯预处理HL-60细胞，则1，25-二羟基维生素D3呈时间和剂量依赖的方式增强HL-60细胞分化为单核细胞，小白菊内酯通过抑制NF-KB的结合活性显著增加HL-60细胞分化的程度，而不具有抑制NF-KB的倍半萜内酯化合物蛔蒿素不能增加HL-60细胞的分化；转染实验发现，小白菊内酯增强维生素D受体反应元件依赖的促进剂的活性，通过抑制NF-KB信号通路的激活剂TNF-0恢复，25-二羟基维生素D3诱导的VDRE依赖的促进剂的活性 。小白菊内酯和其类似物LC-1能够单独或共同对造血细胞起抗肿瘤作用，包括有急性髓性白血病 、前B细胞型急淋和慢性淋巴细胞白细胞。在不同的急性髓性白血病细胞株，小白菊内酯能够抑制组蛋白脱乙酰基酶抑制剂介导的NF．KB激活和促进SAPK/eJNK激活和凋亡 。

6. 抗血小板作用

小白菊内酯在一些类型的癌细胞可以通过抑制NF-KB和诱导氧化应激来诱导凋亡、分化和增殖。有趣的是，这两种途径都与巨核细胞突变和血栓形成的最后阶段有关。研究发现，小白菊内酯通过抑制巨核细胞的NF-KB途径增强血小板产物可独立于其诱导的氧化应激反应，小白菊内酯在增强功能性血小板产物的同时减轻了不必要的血小激活，其他研究也提示小白菊内酯能够直接非依赖性地增强血小板产物 。在抗血小板药物方面，也需要一种药物在抗血小板的同时能够减少不必要的血小板激活，以此减轻炎症反应。小白菊内酯介导的其他的抗血小板机制包括花生四烯酸代谢的变化和与蛋白激酶C 的相互作用。

7. 抗病毒

小白菊内酯具有抗病毒活性，作为一种前驱化合物，小白菊内酯在半数有效浓度时能够在亚基因组RNA复制子测定系统抗丙型肝炎病毒复制，一个成功的抗病毒治疗需要鸡尾酒添加疗法，在丙肝病毒复制子系统，联合干扰素一后小白菊内酯表现出添加效应。

8. 抑制原虫的生长

小白菊内酯能够抑制利什曼原虫和克氏锥虫的生长，并且能够使上鞭毛体的形态活动度发生改变。而杀锥虫药对氨甲酰甲胺苯胂酸钠联合1 g/mL小白菊内酯可以诱导克氏锥虫虫体圆绕和缩短，并且使浆膜的完整性丧失，浆膜形状和结构的改变可能是由于药物作用浆膜下的微导管所致，进一步表明小白菊内酯和抗原虫药物有协同作用。

【制备】^[4]

一种从广玉兰根皮中分离提取小白菊内酯的方法，该方法包括以下步骤：

1）取广玉兰干燥根皮，粉碎成粉；

2）取粉碎的粗粉，用5～20倍重量的适当的提取溶剂在室温浸泡多次，每次36-108小时。

3）过滤，合并滤液，减压回收溶剂得提取浸膏；

4）提取浸膏用质量浓度10％-30％的乙醇或甲醇溶液溶解，再用适当的有机溶剂萃取至颜色变淡，合并有机溶剂，减压回收有机溶剂，干燥得总倍半萜内酯类化合物；

5）取上述总倍半萜内酯类化合物上硅胶色谱柱，以混合有机溶剂梯度淋洗，跟踪检测，收集含小白菊内酯的流份，合并减压回收混合有机溶剂，干燥得小白菊内酯。上述方法还可以包含小白菊内酯的结晶过程，结晶过程如下：

6）小白菊内酯在适当的溶剂中得无色结晶状化合物小白菊内酯。

【参考文献】

[1] 李申恒, 李小云, 周伟东, 等. 小白菊内酯及其衍生物药理作用研究进展[J]. 中成药, 2012, 34(10): 1990-1994.

[2] 徐惠君, 佟仲生, 贾勇圣, 等. 小白菊内酯抗肿瘤作用机制研究进展[J]. 中成药, 2013, 35(9): 1985-1988.

[3] 张磊, 陈凡, 王京. 小白菊内酯的结构修饰, 生物活性及构效关系研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2017, 29(9): 1617-1620.

[4] 张泉；龙寿江；陈悦；翟佳黛；张福武；范洪霞；马维维.小白菊内酯的制备方法. CN201010168478.7，申请日2010-05-11