1783-96-6/制备d-天门冬氨酸的方法和组合物

相关技术描述L-天门冬氨酸-α-脱羧酶催化从L-天门冬氨酸中产生β-丙氨酸。Nakano等表明了来自大肠杆菌B株的粗提取物中有此酶活性。Nakano，Y.等，生物化学杂志；70卷，327-334页(1971)。Williamson等进一步研究了把大肠杆菌中的该酶纯化到表观均一后的酶活性。Williamson，J等，生物化学杂志，254(16)卷，8074-8082页(1979年8月)。这些发明的文献并不说明除了实验的好奇外，能产生任何可实际应用的酶量。正如下面更全面讨论的那样，本发明利用一种组合物，使L-天门冬氨酸-α-脱羧酶的活性为Nakano等和Williamson等文献中发表的该酶活性的100～2000倍。

在给Rozzell的美国专利号5,019,509中公开了产生L-丙氨酸和其衍生物的方法和组合物。然而，Rozzell公开了编码天门冬氨酸-β-脱羧酶的基因以及用于产生L-丙氨酸。在给Houng的美国专利号5,552,317和5,552,318中，公开了用来自小麦胚或解脂假丝酵母(Candidalipolytica)的脂肪酶制备旋光活性氨基酸和其酯类的方法。相比之下，本发明的方法不是如Houng等方法那样的常见转变方法，常见的方法是，氨基酸的转变实际上依靠氨基酸的衍生物进行，因而需要额外的化学步骤。最为常见的方法是，外消旋酯类用酯酶/脂肪酶处理，或N-乙酰氨基酸用酰基酶处理。

已知的其他转变程序是应用酰胺酶，作用于消旋的氨基酸酰胺，其中该酶恰特异地针对一种异构体。见美国专利号4,880,737。然而，本发明提供一种更为简单的方法，因为不用额外的化学修饰以制备底物。

本发明提供容易的途径，从丰富的资源D，L-天门冬氨酸中，产生2种广泛使用的化合物。在药用中，已有大量的文献描述D-天门冬氨酸和其衍生物。这些应用包括，但不局限于抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性和用作免疫抑制剂。抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性，可用于预防或治疗脓毒症或细胞因子诱导的系统性低血压。D-天门冬氨酸的其它应用包括作食物的味觉修饰组合物，和由Pfizer开发的一种新甜味剂，AlitameTM。另外，β-丙氨酸用于泛酸的合成，而泛酸对辅酶A的合成是必需的。也已知β-丙氨酸用作手性合成子合成α-替代的β氨基酸。β-丙氨酸的衍生物已被用作电镀业中的缓冲液。

制备方法

质粒pIF309的制备编码L-天门冬氨酸-1-脱羧酶的panD基因，从大肠杆菌K12染色体中，用下列PCR方法分离

A.染色体DNA制备大肠杆菌W3110菌株从Coli遗传贮存中心(耶鲁大学，Newhaven，CT)获得。菌株按照提供者的指示复苏，在500ml培养瓶中37℃下，50ml体积的Luria肉汤中摇动培养过夜。10ml等份培养物10,000×g离心4分钟。弃去上清液，沉淀重新悬浮在1ml的含50mMTris/HClpH8.0，10mMEDTA和100μg/mlRNaseA(Sigma)的溶液中。溶液在室温下温育10分钟。加入2ml的含0.4％(w/v)十二烷基硫酸钠(“SDS”)和100μg/ml蛋白酶K(Sigma)的溶液。37℃下温育溶液20分钟。加入pH5.2的乙酸钠至终浓度为300mM。然后，该溶液用37℃的等体积的苯酚抽提3次，用2.5倍体积的乙醇沉淀。然后用无菌环移取DNA，DNA重新溶解在400μlpH5.2的300mM乙酸钠中。然后，DNA用2.5倍体积的乙醇重新沉淀，按前述的方法移取，干燥，溶在500μl的10mMTrispH8.0和1mMEDTA中。终浓度大约为200μg/ml。

B.通过PCR扩增panD通过PCR扩增大肠杆菌panD基因，用0.2mlMicroAmpTM反应管(PerkinElmer，Norwalk，CT)完成，在反应管中加入100ng如上述制备的大肠杆菌染色体DNA，dATP、dGTP、dCTP和dTTP(每种10mM)各2μl，10μl含有15mMMgCl、500mMKCl、100mMTrispH8.3的缓冲液和0.01％(w/v)明胶，5UTaqDNA聚合酶(AmpliTaqTM)和5μl10nmol/ml的下列每种寡核苷酸引物溶液，寡核苷酸引物根据已知的方法，用应用生物系统380BDNA合成仪合成。(MB1682)5′CGCGGATCCACTATGATTCGCACGATGCTGCAGGGC3′(MG1683)5′CAGCGTGCATGCTCAAGCAACCTGTACCGGAATCGC3′反应在PerkinElmer9600TMPCR热循环仪(PerkinElmer)中进行。扩增反应按下列方法进行，94℃预热3分钟，接着94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共30个循环。然后反应混合液贮存在4℃。

C.panD的克隆扩增的panD基因克隆到来源于质粒pBR322的质粒载体上。该质粒命名为pIF309。含有panD基因的片段用限制性酶BamHI和SphI完全消化，连接到相似方式切割的载体单独BamHI和SphI位点之间。在HindIII和BamHI之间插入合成的DNA片段，该DNA片段带有大肠杆菌K12pheA启动子区的修饰变体。该片段完全在应用生物系统380BDNA合成仪上合成，资料来源于与Fotheringham等共有的美国专利5,120,837。上述序列见如下：HindIIIAAGCTTTTTTGTTGACAGCGTGAAAACAGTACGGGTATAATACTAAAGTCACAAGGAGGATCCBamHI质粒pIF309在图1中显示。限制性消化用由新英格兰生物实验室公司提供的酶进行，根据制造商的具体说明(NEB，Beverly，MA)使用。使用由Takara生物化学公司(PanveraCorp.，MadisonWI)提供的连接反应试剂盒，根据制造商的具体说明进行DNA片段连接。

通过从按如下描述生长的NS3291菌株培养物制备的提取液中，生物学测定L-天门冬氨酸-1-脱羧酶活性确定panD的表达。