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10-甲酰叶酸是一种叶酸衍生物。叶酸是一种具有重要营养价值的水溶性B族维生素，是指四氢叶酸及其衍生物这一类物质，它由蝶啶、对氨基苯甲酸和谷酰基链组成。作为一碳供体，叶酸参与嘌呤、嘧啶的合成和氨基酸的相互转化。人体缺少叶酸会导致一系列的慢性疾病，例如神经管缺陷、先天缺陷、巨红血球性贫血、心血管疾病和癌症等。
CN201510527402.1报道了一种快速高灵敏同步定量检测蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步骤：
1)、提取植物叶片中的叶酸及叶酸衍生物：
利用0.05M磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片的叶酸，冷却并离心后，得上清液，上清液为叶酸提取物(包括叶酸及叶酸衍生物)；
2)、添加两种叶酸轭合酶
往步骤1)中的叶酸提取物添加老鼠血清轭合酶和鸡胰腺轭合酶，加入氩气后37℃孵育2小时，100℃水浴5分钟终止酶活，离心后取上清液，上清液为叶酸去轭合提取物；
3)、使用超滤离心管纯化植物叶片叶酸去轭合提取物
使用10kDa500μL超滤离心管(Millipore，美国)，活化后，往里加入500μL步骤2)得的叶酸去轭合提取物，12000g4℃离心15分钟，得到纯化后的叶酸纯化液(为过柱后所得的溶液)；
4)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物质谱方法
超高效液相色谱质谱联用检测系统为四极杆串联质谱(WatersXevoTQ-S,Waters,美国)常压电喷雾电离(ESI)正极模式。WatersIntelliStartTechnology通过自动和手动优化所有叶酸衍生物的多离子反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM)。每一种叶酸衍生物使用两个或三个子离子确定，结果如表1。MassLynx4.1(Waters,美国)软件用于系统运行、数据采集和数据分析。表1叶酸及叶酸衍生物的多离子反应检测和化合物指标
5)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物色谱方法
使用WatersACQUITYUPLC系统(Waters，美国)进行叶酸衍生物的色谱分离，运行软件为TargetLynx4.1(Waters，美国)。柱温箱维持40℃，自动进样器维持4℃。色谱柱是ACQUITYUPLCBEH,C18column，规格为2.1mm×50mm，粒径1.7μm(Waters，美国)连接一个VanGuard前置柱C18，规格为5mm×2.1mm，粒径1.8μm(Waters，美国)。流速0.4mL/min；进样量2μL，运行时间5分钟。流动相为洗脱液A(0.1％甲酸溶于水)和洗脱液B(0.1％甲酸溶于乙腈)梯度洗脱，详见表2。针头清洗溶剂为乙腈/水混合液(50/50,v/v)；表2UPLC-MS/MS最佳梯度洗脱
6)、植物叶片叶酸衍生物的定量测定。
作为本发明高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的改进：步骤1)中的0.05M磷酸缓冲液浓度为每升加入10gL(+)-抗坏血酸和10ml二巯基丙醇的磷酸缓冲液。
作为本发明高效高灵敏同步定量测量植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的进一步改进：所述步骤2)中在每10mL叶酸提取物中加入2mL鸡胰腺轭合酶，摇匀后，吸取3mL溶液于50mL离心管中，加入100μL老鼠血清轭合酶，摇匀，充入氩气，37℃孵育2小时，100℃水浴5分钟终止酶活。
作为本发明高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的进一步改进：所述步骤6)为：根据步骤4)和步骤5)的条件，对植物叶片叶酸及其衍生物进行定量测定，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积自动计算得出四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的含量，再根据四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的浓度和相对分子质量计算总叶酸含量。
[1][中国发明,中国发明授权]CN201510527402.1快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法