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青霉素V钾是青霉素类β-内酰胺类抗生素，临床 及实验研究证明，β-内酰胺类抗生素引发的过敏反应是由其中的高分子聚合物产生的[1-3]，更好地控制β-内酰胺抗生素聚合物的含量，将在未来的药品质量控制中成为主流[3]。《中国药典》2010年版采用SephadexG10凝胶柱[5]，分离测定青霉素V钾片中的 高分子聚合物，但在实际应用中发现有一些问题，如：柱效低，方法中仅要求理论塔板数不低于400；峰形拖尾，方法中只要求拖尾因子不大小于2.0 即 可；分析一个样品包括系统适用性试验和样品测定 至少需要3个多小时；测定中使用两种流动相和青霉 素对照品使得试验和计算较为繁琐等，近年来也在 不断发展高效凝胶色谱系统，以克服Sephadex G10 凝胶色谱系统的弱点，逐步完善着对抗生素高分子聚合物的控制理念[4]。故开发更为简单方便快捷可靠 的高效凝胶色谱测定方法解决药典方法存在的弱点 是聚合物测定方法改进的目的。经过方法探索和验 证决定采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，照分 子排阻色谱法使用TSK-GEL G2000SWXL高效凝胶 色谱柱(7.8mm×300mm，5μm)，以低浓度的磷酸盐 缓冲液和乙腈(95/5)为流动相，柱温为25℃，流速为0.7mL/min，检测波长为254nm进行青霉素V钾片中高分子聚合物的测定，见图1。
Alltech1500高效液相色谱仪(美国奥泰科技有限 公司)；色谱柱Tsk-gelG2000SWXL(7.8mm×300mm,5μm，日本东曹公司)；CP220D电子天平(德国赛多
利斯集团)。青霉素V化学对照品(批号：130490-200904， 含量：89.3%，中国药品生物制品检定所)；青霉素 V钾片 (规格：0.25g，批号：AX2420、AX2421、AX2422，山德士制药有限公司)；乙腈为色谱纯(国 药集团化药试剂有限公司)，水为超纯水，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等(成都市科龙化工试剂厂，AR)。
2.1 色谱条件
色谱柱为Tsk-gelG2000SWXL(7.8mm×300mm，5μm)，流动相为0.06mol/L磷酸盐缓冲液(0.06mol/L磷酸二氢钠溶液，调pH值至7.0)/乙腈=95/5；检测波 长为254nm，进样体积为20μL，柱温为25℃，流速 为0.7mL/min，检测波长为254nm，理论塔板数不低 于2000，色谱图见图2。
2.2 溶液的配制
精密称取适量青霉素V化学对照品，加水溶解制 成含青霉素V 36μg/mL的对照品溶液；另精密称取适量青霉素V钾片内容物，加水溶解制成4.0mg/mL的溶液(临用新制) 用0.22μm的微孔滤膜过滤，弃去初 滤液，取续滤液作为供试品溶液，将样品溶液置80℃ 水浴中30min，放冷至室温用0.22μm的微孔滤膜过滤， 弃去初滤液，取续滤液作为系统适用性样品溶液。
2.3 专属性试验
分别精密吸取青霉素V对照品溶液、供试品样品 溶液、和高温、光照、酸碱和氧化的强制降解样品 溶液各20μL注入液相色谱仪，按“2.1 色谱条件”下 方法进行分析，记录色谱图。结果在该色谱条件下 所有强制的条件下降解产物与青霉素V钾的峰是分开 的，方法专属性良好。
2.4 线性范围考察
取青霉素V钾对照品13.59mg，精密称定，用超 纯水配制成浓度为121.3587μg/mL的对照品储备溶 液，准确移取储备液0.5、1、2、3、4、5和6mL分 别置于10mL量瓶中，用超纯水稀释定容至刻度，摇 匀即得浓度分别为6.067935、12.13587、24.27174、36.40761、48.54348、60.67935和72.81522μg/mL的标准品溶液，分别吸取20μL进样，记录色谱图。以对 照品峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标进行线性回 归，其线性方程为：A=2936C+324.32(r=0.9999)。结 果表明青霉素V钾在浓度为6.068~72.815μg/mL时与 峰面积的线性关系良好。
2.5 检测限试验
精密称取本品，加超纯水溶解并稀释至浓度为0.364μg/mL，进样20μL时有明晰的色谱峰，信噪比为3.1(n=6，RSD=1.07%)，可认为检测限0.364μg/mL。
2.6 稳定性试验
按2.2项下新制备对照品溶液和供试品溶液(批 号：AX2420)各1份，室温放置，按上述色谱条件分 别于0、0.5、1、2、3、4和8h进样分析，记录对照品 溶液和样品溶液各色谱图的峰面积，得对照品溶液 主峰峰面积的RSD值为0.55%(n=6)，结果表明对照品 溶液在8h内稳定性良好；但供试品溶液在常温下1h 后各个时间点其高分子聚合物杂质的含量都在明显 地增加，表明供试液在常温下不稳定，须临用前现配。
2.7 精密度试验
精密吸取2.2项下同一对照品溶液20μL，连续进样6次，其峰面积的RSD =0.36%，表明仪器精密度良好。
2.8 重复性试验
取同批青霉素V 钾片( 规格：0.25g ，批号：AX2420) 样品，配制成供试样品溶液5 份( 临用现 配)，按“2.1”项下色谱条件重复测定其聚合物含量，按外标法以峰面积计算其高分子聚合物含量分别为0.989%、0.984%、0.972%、0.998%、0.969%和0.991%，RSD =1.15%，结果表明分析方法重复性良好。
精密量取20μL对照品溶液，进样，以流速0.7mL/min照“2.1 色谱条件”下方法进行测定，记录色谱图。另取20μL样品溶液，进样，以流速0.7mL/min同法测定。按 外标法以峰面积计算青霉素V钾高分子聚合物的含量。3批样品的测定结果如表1。
4.1 新方法与药典方法的比较
《中国药典》2010年版青霉素V钾片项下使用分子 排阻色谱法(附录Ⅴ H)对高分子聚合物进行测定[5]。
4.1.1 中国药典色谱条件
以葡聚糖凝胶G-10(40~120 μ m) 为填充剂，以pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液[0.1mol/L磷酸氢二 钠-0.1mol/L磷酸二氢钠(61:39)]为流动相A，水为流动相B，流速为每分钟1.5mL，检测波长为254nm，进样体积为100~200μL，理论塔板数以蓝色葡聚糖2000峰计算均不低于400，拖尾因子均应小于2.0。
4.1.2 测定方法的比较
药典方法规定对照溶液和样品溶液的进样体积 均为100~200μL，进样量大，进样时间长，对仪器 的进样设备要求高，而新方法只需正常进样20 μ L 即可，进样快准确。药典方法以0.1mg/mL 蓝色葡 聚糖2000溶液分别在流动相A、B中进行测定，规 定在两种流动相系统中主峰峰保留时间的比值应在0.93~1.07之间，理论板数不低于400，拖尾因子均应小于2.0为系统适用性试验；以高聚体的峰高与单体 与高聚体之间的谷高比应大于2.0判断分离度[5]。而 新方法采用一种流动相进行等度洗脱，高分子聚合物峰与青霉素V钾主峰能够完全分离，其主峰前峰分 离度达2.5，主峰后的峰分离度5.6，及对照峰不对称 仅1.2，均优于其他条件。主峰的理论塔板数均不低 于2000，按外标法以峰面积计算青霉素V钾高分子聚 合物的含量。分别用药典方法和新的聚合物测定方 法对3批样品的高分子聚合物含量进行测定，测定结 果如表2。
比较表1~2 中两种方法的高分子聚合物测定结 果，新方法中高分子聚合物峰与青霉素V钾主峰分离 效果较好，达到基线与基线分析，分离度大于1.5，且高分子聚合物峰和青霉素V主峰能够完全分离,分 析时间明显缩短，只需25min便能完成一个供试样品 的分析；而药典方法在分析供试样品前要进行大量 的系统适用性试验，并且是以高聚体的峰高与单体 与高聚体之间的谷高比判断分离度，样品分析时间 较长，分析一个样品要用60min。因此，采用文中所 述新的高分子聚合物含量测定方法较好地解决了药 典方法柱效低、峰型拖尾、重复性不好和分析时间 较长等问题；较药典方法更为简便快捷。
4.2 新方法色谱条件的确定情况
检测波长的选择：参照2010年版《中国药典》二部中收载的青霉素V钾片聚合物测定方法。
流动相选择：磷酸盐缓冲液的浓度分别调整为0.04、0.05、0.06和0.07mol/L配制成流动相，进样记录色 谱图分析。当缓冲液浓度为0.06mol/L，与乙腈的比例为95:5时，高分子聚合物峰和青霉素V钾主峰的分离效果好，因此，磷酸盐缓冲液的浓度选择为0.06 mol/L。