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气态时，三氧化钼由MoO3分子组成，Mo-O之间为双键。固态时，无水三氧化钼为正交晶系，含有变形八面体MoO6构成的层状结构。八面体成链，之间有氧原子交联，八面体中一条Mo-O（非交联氧）键长较短。
三氧化钼晶体
工业上用二硫化钼氧化制备三氧化钼：
2 MoS2+ 7 O2→ 2 MoO3+ 4 SO2
实验室中，则可先由钼酸钠溶液酸化制得三氧化钼水合物，再将其干燥制得：
Na2MoO4+ H2O + 2HClO4→ MoO3(H2O)2+ 2 NaClO4
三氧化钼可溶于碱，生成钼酸盐：
MoO3+ 2NH3·H2O → (NH4)2MoO4+ H2O
根据pH的不同，钼酸盐可以以正钼酸盐或多钼酸盐存在。
三氧化钼高温与氢气反应，最终产物是金属钼。金属钼即通过此法制取：
MoO3+ 3 H2→ Mo + 3 H2O
三氧化钼在160 °C水热条件下和氟化钾、氢氟酸反应，可以得到无色的KMoO2F3晶体。用类似方法可得到相应的铷、铵、铊(I)盐。
1、用于比色法测定血糖键供、蛋白质、酚、砷、铅、铋等，生物碱检验。用作五氧化二磷、三氧化砷、双氧水、酚和醇类的还原剂。也用于制备钼盐、钼合金。
2、用作制取金属钼及钼化合物的原料。石油工业中用作催化剂。还可用于搪瓷釉药颜料及药物等。
3、本品为添加型阻燃剂，具有阻燃和抑烟双重功能，与其他阻燃剂复配可降低成本，提高阻燃性，减小发烟量。三氧化钼也有阻燃和抑烟的双重作用，它与三水合氢氧化铝和氧化锑都显示了一定的协同效果。
4、光谱分析试剂。血糖、蛋白质、生物碱、砷、酚的检测。五氧化二磷、三氧化二砷、双氧水的还原剂。
5、三氧化钼在配制钼酸盐中用于电镀或用作金属氧化添加。
用作高效阻燃抑烟剂，对于含氯胶黏剂更为有效。参考用量0.5～5.0份即能使生烟量降低30%～80%，氧指数提高10%~20%。钼化物与氧化铜、氧化铁：氧化镉、氧化锌等混合使用用具有协同效应，其抑烟效果比单一MoO3更佳。国内阻燃抑烟剂多为氧化钼、钼酸铵的混合物。