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线粒体的外膜含有孔蛋白，当孔蛋白通道完全打开时，可以通过相对分子质量为5KDa的分子。ATP、辅酶A等相对分子质量小于1KDa的所有物质都能自由通过外膜。由于外膜的通透性很高，使得莫间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。丙酮酸的分子量是88.06，因此可以自由通过线粒体的外膜。
线粒体内膜对物质的通透性很低，能严格控制分子和离子通过，实际上，所由分子和离子的运输都需要借助膜上的一些特意的转运蛋白。
由于丙酮酸属于带电分子，因此其进入细胞的方式是主动运输：
对于丙酮酸进入线粒体内膜的这种主动运输，直接能量来源并不时ATP，而是与氢离子一起同向转入线粒体基质中，即次级主动运输：
