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9031-72-5 / 乙醇脱氢酶的制备

背景[1]

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是一种含锌酶类,在机体内分布有较高器官特异性,在肝脏内最为丰富。在正常机体生理代谢中,ADH能够催化乙醇(酒精)代谢。在临床上,血液中ADH的含量是诊断肝脏疾患的指标之一,在正常情况下,ADH在肝脏中含量最高,血清中的ADH是恒定的。当在肝脏受损时,如急性中毒性肝损伤、酒精肝病、慢性活动肝炎等,ADH由细胞内释放到血清中,从而引起ADH在血清中升高。

目前在人体内发现了7种亚型,分别为ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH4、ADH5、ADH6和ADH7

结构[2]

ADH1B晶体结构

乙醇脱氢酶的制备

制备[2]

目前人源的ADH的获取主要通过原核表达方式生产,主要是通过肝脏中提取mRNA,经RT-PCR扩增目的基因,构建至表达载体,转化至表达感受态,获量表达ADH蛋白的大肠杆菌,以M9培养基对大肠杆菌大量培养,诱导表达,大量制备出ADH蛋白,经相应的纯化工艺,获得纯品ADH。此生产方式成本低,需要的设备相对较少,其中最常用和重要的是大肠杆菌培养基,它是影响ADH的产量关键因素之一,目前市面常用的是M9,配制简单,且原材料易于获取。

人血清中乙醇脱氢酶检测

目前监测人血清中ADH含量的常用方法是双抗夹心酶联免疫分析(ELISA)。该方法是敏感性高,特异性强,操作简易,且结果易于观察。其主要原料是ADH和两个ADH抗体,分别用于包被和标记酶。首先将ADH抗体包被到ELISA板中,制成固相抗体,在微孔中加入不同浓度的ADH标品进行反应,经过洗涤去除非特异性结合,再加入酶标记的抗体,进行反应,形成ADH抗体—ADH—酶标记的ADH抗体的复合物,经过彻底洗涤后,加入酶底物和显色剂,在酶催化底物后,液体呈现显色反应,显色强弱与ADH的含量呈正比,在酶标仪中读取OD450/ OD600值。以OD450/ OD600值纵坐标(y轴),以ADH不同的浓度为横坐标(x轴),建立标准曲线和方程。将待测血清加入ELISA试剂盒 中进行检测,根据其OD值,代入方程,计算出相应含量。

在试剂盒建立过程, 除主要原料影响之外,其中影响最大的就是稀释液。如抗体稀释液、ADH稀释液,都会影响到试剂盒的特异性和稳定性,目前,在稀释液中都会添加一种或多种成份如BSA、酪蛋白、鸡标准血清、牛血清、马血清等等,来提高试剂盒的抗干扰能力和稳定性。

主要参考文献

[1] 卢现英.ADH检测的临床新研究[J].中外医疗.2011.01(c):0192

[2] Niederhut, M.S., Gibbons, B.J., Perez-Miller, S., Hurley, T.D.Three‐dimensional structures of the three human class I alcohol dehydrogenases [J].Protein Science.2001,10(4):697-706