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由于具有简单的比色读数，基于过氧化物酶的检测方法备受关注，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体用于免疫组织化学和ELISA、纳米酶和DNA酶。自从3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）首次在基于HRP的免疫分析中应用以来，TMB是迄今为止最常用的生色底物，其显色反应基于H2O2存在下HRP催化氧化TMB。在TMB出现之后，逐渐取代了其他联苯胺衍生物在比色测定中的使用。在研究和评估纳米酶的过氧化物酶和氧化酶样活性的过程中，TMB在大多数情况下被用作标准底物。取代其他联苯胺衍生物的一个重要原因是它们的高致癌性。联苯胺衍生物的发色敏感性是分析化学最重要的参数之一，但从化学角度明确阐述TMB的变色原理优于其他联苯胺底物具有重要意义。
近期，四川大学吴鹏教授课题组报道了联苯胺类底物的化学性质与显色反应的分析性能之间的关联。该体系选择了九种具有不同特性（不同取代基和不同取代数）的联苯胺衍生物，并用四个典型的TMB生色系统（HRP，纳米酶，DNAzyme，光敏氧化方案）进行了研究。在现有联苯胺底物用于过氧化物酶的测定中，TMB表现出最高的灵敏度，更好的有色产物色纯度和合理的氧化产物稳定性。与TMB以外的两种四取代的联苯胺衍生物进行比较，TMB的性能（灵敏度，色纯度和有色产物的稳定性）具有很大优势，在比色测定中证实了其“选定底物”的状态。相关成果以“The Rationale of 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) as the Chromogenic Substrate in Colorimetric Analysis”为题发表在国际分析化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02149）。
图一、联苯胺类似物与四个显色反应系统之间定量比较的示意图
首先，作者研究了对不同联苯胺底物的选择。TMB氧化的显色反应基于以下核心部分：联苯胺，其包含两个易于氧化的氨基，可以通过单电子和两电子途径被氧化为有色产物。取代基的给电子和吸电子性质会影响氨基上的电子云密度，因此可能影响联苯胺衍生物的氧化反应性。从平均局部电离能图可以看出，联苯胺上氨基的电子云密度低于3,3'-二羟基联苯胺但高于3,3'-二氯联苯胺，表明这三种衍生物的反应活性可能不同。另外，作者确定了九种联苯胺底物的光谱特征，其中联苯胺在近紫外线范围内表现出典型的吸收带。
图二、联苯胺衍生物的显色反应，结构以及部分底物的ALIE图。
接着，作者研究了联苯胺底物的氧化特性。由于联苯胺的氧化过程分两个步骤进行，以TMB为例，371 nm和652 nm带是由二胺（TMB）作为供体和二亚胺基离子（TMB2+）作为受体组成的电荷转移络合物。根据两个吸收峰之间的差异，可以将7种底物（2Cl除外）分为三类：差异组（4CH3和2CH3），部分重叠的组（2H和2OCH3）和一个重叠的组（2NH2和2OH）。通常，甲基取代的联苯胺衍生物比其他的具有更好的差异吸收峰。4CH3（TMB）和2CH3的色纯度通常优于其余衍生物，并且TMB的半高全宽也小于静止的基板，这些结果证明了TMB（4CH3）的光谱和色纯度可以在吸收测量和肉眼读数方面实现更好的量化。为了研究七种联苯胺底物的敏感性，作者使用四个生色系统对其进行测试。图三中总结了七个生色系统中七个联苯胺类似物的相对灵敏度。通常，CH3-和OCH3-取代的联苯胺衍生物的敏感性高于其他衍生物。无论发色系统如何，4CH3（TMB）都表现出最高的灵敏度，证实了其在比色测定中的“选定底物”状态。酶动力学参数的测量也表明4CH3（TMB）在显色系统中通常表现出较高的Vmax和较低的Km。
图三、联苯胺衍生物的氧化特性和敏感性研究表征图。
最后，作者研究了氧化产物的稳定性。有色物质的稳定性对于比色测定中的定量非常重要。作者通过“C点和LED”光敏系统探索了用于收集被氧化底物的吸光度变化。联苯胺底物的颜色读数与氧化产物稳定性之间的区别已通过其氧化还原电势进行了验证。从4CH3（TMB）获得了分别对应于单电子和双电子氧化的两对氧化还原峰，良好分离的峰表明两个氧化步骤可以逐步进行而基本不重叠。从1 h后单电子氧化产物的吸收光谱变化中证实了它还保证了单个氧化产物的稳定性。对于2OCH3，由于单电子和两电子氧化产物的混合物共存，两个氧化峰之间存在明显的重叠，另外这种氧化产物不稳定，并在短时间内自发地转变为两电子对应物，使吸光度测量成为问题。对于2NH2，氧化还原峰很难区分，并且在一步中就被氧化成两电子产物，但是相对较低的氧化电位（0.13 V）使2NH2易于在空气中发生自氧化。在7种底物中，4CH3（TMB）的电势差最大，因此难以形成混合氧化产物，并且TMB的两电子氧化产物可保持稳定至少1 h。该研究证实了TMB在单电子氧化或两电子氧化过程中，对于UV-vis定量和肉眼读数均具有合理的稳定性。
图四、联苯胺衍生物的氧化产物的稳定性研究表征图。
另外，2OCH32CH3的单电子和两电子氧化产物的光谱类似于2CH3和4CH3（TMB）的光谱；4OCH3的单电子和两电子氧化产物的光谱出现重叠。RGB值所揭示了这些四取代底物的氧化产物的色纯度通常也优于联苯胺和二取代衍生物。另外，2OCH32CH3的单电子氧化产物的稳定性较差，这可能是因为氧化还原峰的电位差较小；4OCH3的单电子氧化产物的稳定性甚至更低，而两个氧化还原峰几乎没有任何特征。对于双电子氧化产物和原始化合物的稳定性，4CH3（TMB）的性能仍优于2OCH32CH3和4OCH3。因此，在低致癌性四取代底物中，TMB仍然具有最高的灵敏度，色纯度和合理的稳定性。
图五、四取代-联苯胺衍生物的氧化产物的稳定性研究表征图。
小结：四川大学吴鹏教授课题组从发色反应和分子特性探讨了TMB作为比色测定中选定底物的基本原理。通过发色系统的研究，证明TMB表现出优于其他联苯胺衍生物的最佳灵敏度。单电子氧化产物和两电子氧化产物之间明显的电势差使其成为定量分析的最佳选择。TMB作为显示底物不仅与其低毒性有关，还与其分析性能以及分子特性有关。另外，甲基取代的联苯胺（2CH3、4CH3和2OCH32CH3）的性能通常优于其他类似物。四取代的衍生物大多优于二取代的衍生物。