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羟苯磺酸钙（CaD）作为血管保护性药物，具有抗炎、抗氧化、抗血管再生作用，在临床中被广泛用于治疗糖尿病微血管并发症，包括糖尿病视网膜病变（DR）、糖尿病肾病（DKD）等。临床研究发现，羟苯磺酸钙可减少DKD患者蛋白尿，但其具体机制是什么？天津医科大学朱宪彝纪念医院陈莉明教授团队开展的一项基础研究对此进行了深入探索，研究成果发表于Frontiers in Pharmacology杂志[1]。
近期有研究证实，糖尿病肾病患者的肾组织中多种细胞的自噬水平异常、血管内皮生长因子（VEGF）与VEGF受体病理性表达增多、PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化水平异常升高与白蛋白尿的产生有紧密联系。羟苯磺酸钙作为微血管保护剂，改善DKD的机制究竟是什么？基于此疑问，特开展本研究来探讨羟苯磺酸钙对糖尿病小鼠白蛋白尿的作用，探究其对小鼠肾脏内自噬活性的作用，同时证明其可能作用的信号通路。
该研究应用KK-Ay自发性糖尿病小鼠和HFD/STZ诱导糖尿病小鼠DKD模型，分别取半数小鼠给予羟苯磺酸钙试剂灌胃治疗12周，其余小鼠以同样方式给予纯水灌胃12周，C57BL/6小鼠作为空白对照组。观察指标及检测方法包括：
1.一般情况及生化指标：包括空腹血糖、尿微量白蛋白排泄率（UAE）、血肌酐、总胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶等；
2.组织形态学：通过HE染色、PAS染色、Masson染色方法检测肾小球及肾小管间质的组织形态学变化，并测算肾小球平均容量；
3.免疫组化方法检测足细胞结构性蛋白Nephrin和Podocin的表达情况；
4.免疫组化和Western blot凝胶电泳实验用于检测肾组织中自噬相关蛋白（LC3、ATG-5、Beclin-1、P62）在肾组织中的表达情况；
5.Western blot方法检测小鼠肾脏中VEGF及其受体2、PI3K/AKT/mTOR自噬相关通路磷酸化蛋白与总蛋白的相对表达情况。
总的来说，该实验的设计思路就是通过观察蛋白尿变化→肾结构变化→蛋白尿生成的关键细胞→影响蛋白表达的通路，层层递进、抽丝剥茧，揭示羟苯磺酸钙的可能机制。
01.羟苯磺酸钙显著降低DKD小鼠的蛋白尿
在两种糖尿病肾病小鼠模型中，羟苯磺酸钙治疗均可显著减少DKD小鼠升高的尿白蛋白排泄率：KK-Ay小鼠和HFD/STZ小鼠中，UAE（μg/24h）分别为7.11 vs. 11.23和0.37 vs. 2.13（均P<0.05）。
而且，羟苯磺酸钙治疗后的DKD小鼠空腹血糖、体重、血肌酐、总胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶与未治疗的小鼠相比无明显差异（均P>0.05），提示羟苯磺酸钙对糖脂代谢等无明显影响。
02.羟苯磺酸钙减轻肾组织破坏
DKD小鼠肾脏组织中结构模糊，肾小球结构不规则、体积增大，肾小管上皮细胞排列紊乱，近段肾小管呈空泡样变性，细胞核形态不一，系膜区膨胀，肾小球与肾小管间质中的纤维化明显。经羟苯磺酸钙治疗后，DKD小鼠肾脏组织中上述组织形态变化有明显改善。
03.羟苯磺酸钙保护足细胞，修复滤过膜损伤
一旦足细胞结构受损，肾小球滤过膜的屏障就会被破坏，蛋白漏出而产生蛋白尿。Nephrin和Podocin作为足细胞特异性蛋白，其表达情况可反映滤过膜结构和功能是否正常。
DKD小鼠的肾组织中，Nephrin和Podocin的表达含量下降，提示滤过膜损伤严重。羟苯磺酸钙治疗组小鼠的肾组织中，Nephrin和Podocin的表达含量明显恢复（P<0.05），提示羟苯磺酸钙对足细胞的结构具有一定的保护作用，可修复滤过膜损伤。
04.羟苯磺酸钙恢复DKD小鼠肾脏自噬活性
自噬是真核细胞循环利用的一个关键过程，以处理各种应激条件下的分解产物和无用物质，从而维持细胞内稳态。近年来研究表明，糖尿病小鼠出现蛋白尿通常伴有足细胞特异性自噬缺陷。自噬的药理学诱导对于改善糖尿病患者肾功能具有很好的治疗潜力。
该实验结果进一步确定了DKD进展过程中发生的自噬改变，并验证羟苯磺酸钙的确可改变自噬。与DKD小鼠相比，经羟苯磺酸钙治疗后的小鼠LC3、Beclin-1、ATG-5自噬相关蛋白在肾小球和肾小管间质内的表达含量显著增多，P62蛋白表达降低（P<0.05），提示自噬水平恢复。
05.羟苯磺酸钙降低VEGF和VEGFR-2表达，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路
在高血糖等应激条件下，VEGF及其受体2（VEGFR-2）过度表达，可通过诱导血管生成和血管通透性增加进而导致肾损伤。该研究证实，羟苯磺酸钙可降低DKD小鼠肾脏中增多的VEGF与VEGFR-2表达含量（P<0.05）。
PI3K/AKT/mTOR信号通路作为VEGFR-2下游的信号通路之一，其在高血糖时磷酸化水平增高。本实验进一步发现，经羟苯磺酸钙治疗后，该通路磷酸化水平明显下降（P<0.05），提示该药可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR途径来下调VEGF/VEGFR-2的活化以及恢复自噬水平。
根据以上结果，构建出羟苯磺酸钙干预的假设路径如下。
从研究意义看羟苯磺酸钙的临床应用
DKD是糖尿病的主要微血管并发症之一，也是导致终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要因素。迄今为止，DKD尚无治愈策略，因此迫切需要探索其发病机制，开发出特异性的有效治疗方法。肾损伤可由多种因素导致，微血管病变被认为是主要病理生理机制，因而维持DKD早期微血管的结构和功能，减少蛋白尿，对保护肾功能至关重要。
既往研究已证实羟苯磺酸钙能减少DKD患者的蛋白尿，但知其然也要知其所以然，有必要对其相关机制进行深入探讨。本研究首次证明，在KK-Ay小鼠和HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠中，羟苯磺酸钙通过VEGF/PI3K/Akt/mTOR通路恢复自噬，减少蛋白尿。这为羟苯磺酸钙的临床获益提供了新的理论基础。
实际上，羟苯磺酸钙最早用于DR的治疗，但DR和DKD通常相伴发生，两者的发病机制也有相似之处。羟苯磺酸钙能同时治疗DR和DKD，起到“一石二鸟”的作用，对糖尿病患者来说非常有意义。
临床实践中，无论是DR还是DKD，均应重视早期筛查，早发现、早干预对于预防疾病进展至关重要。在疾病早期阶段就起始羟苯磺酸钙，可更好地发挥药物的视网膜和肾脏保护作用。此外，基于临床研究和实践经验，该药对微血管的修复作用需要一段时间的积累，病情改善通常至少需要3个月至半年，甚至更长时间。由于随着病程延长，DR和DKD病情也在不断进展，微血管保护剂的治疗也应长期坚持，即早期起始、全程应用，以使药物尽可能发挥出最佳保护作用。
本实验证实，在糖尿病肾病小鼠体内，羟苯磺酸钙通过恢复自噬水平，降低肾小球滤过膜通透性，从而显著减少白蛋白尿的产生，此作用可能与羟苯磺酸钙抑制了VEGF/VEGFR-2和PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。这次探索进一步揭示了羟苯磺酸钙的作用机制，在知其所以然之后，临床早期、全程应用微血管保护剂的策略就有了更坚实的理论基础。
参考文献：1. Wang Y, Lu YH, Tang C, Xue M, Li XY, Chang YP, Cheng Y, Li T, Yu XC, Sun B, Li CJ, Chen LM. Calcium Dobesilate Restores Autophagy by Inhibiting the VEGF/PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2019 Aug 9; 10: 886. doi: 10.3389/fphar.2019.00886.