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L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐是合成乌苯美司的起始原料。乌苯美司是氨基肽酶 N( CD13) 和亮氨酸氨基 肽酶的抑制剂，可通过增强宿主免疫功能、抑制肿瘤细胞生长及诱导肿瘤细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用。通过采用全合成方法制备乌苯美司，L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐是合成乌苯美司的起始原料，其光学纯度将直接影响乌苯美司的光学纯度。
因此必须对其对映异构体的含量进行控制，从而控制乌苯美司的光学纯度，确保产品质量。由于 L-亮氨酸叔酯盐酸盐结构中只有一个发色团羰基，使用常规的紫外检测器难以检测。通过参考相关文献，采用 Nα-( 2，4-二硝基-5-氟苯基) -L-丙氨酰胺( Marfey 试剂) 作为柱前衍生试剂，建立柱前衍生化-高效液相色谱法( HPLC) 测定 L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐的对映异构体的方法，能快速、简便、有效地对异构体杂质进行分析检测。
L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐是合成乌苯美司的起始原料。其应用举例如下：合成乌苯美司，以(2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸为原料，与二碳酸二叔丁酯反应，且二碳酸二叔丁酯采用分批逐次的加入方式，制备获得中间体I，中间体I与L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐反应制备获得中间体II，其中L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐作为优选，有利于提高中间体II的收率和纯度，中间体II在酸碱体系下分别脱去保护基团叔丁氧羰酰基和叔丁酯，此操作只需通过酸碱体系调节酸碱值就能有效将保护基团高效脱去，提高乌苯美司成品的收率和纯度。所述工艺路线如下：
(1)制备中间体I(2S，3R)-叔丁氧羰基-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸
将原料(2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸用水溶解，加入10％ 两相溶剂，且用碱水调PH至大于8，分批逐次加入二碳酸二叔丁酯，且溶液PH维持在大于8，加入乙酸乙酯，调PH至1—3，萃取分层 收集有机相，干燥，浓缩结晶，即得；为了提高中间体I的收率纯度，在中间体I的制备过程中，经多次反复试验发现，原料(2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸经水溶解、加入10％两相溶剂，碱水调节PH处理步骤后，加入二碳酸二叔丁酯，其中二碳酸二叔丁酯的加入方式直接影响中间体I的收率，如果采用直接投入二碳酸二叔丁酯与原料(2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4- 苯基丁酸反应，收率较低，当采用分批逐次加入二碳酸二叔丁酯时，中间体I的反应收率显著增加。
在中间体I的制备过程中，制备工艺所采用的两相溶剂为丙酮、甲醇、四氢呋喃中的任意一种；所采用的碱水调PH，碱水为碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液、三乙胺中的任意一种。中间体I的整个制备反应过程均在室温下进行，收率为92％。
(2)制备中间体IIN-[(2S，3R)-3-叔丁氧羰基氨基-2-羟基-4- 苯基丁酰基]-L-亮氨酸叔丁酯
将中间体I及L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐加入四氢呋喃中，冰浴下搅拌后依次加入1-羟基苯并三唑，三乙胺，二环己基碳二亚胺，搅拌过夜，滤除析出的二环己基脲，滤液减压浓缩，用乙酸乙酯溶解后， 依次用稀酸、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，浓缩，石油醚打浆，抽滤即得。
本实验中操作步骤中石油醚打浆是指采用石油醚精制的实验过程，具体是指在浓缩操作后，加入有机溶剂石油醚，升温将固体溶解，搅拌，使溶液在冰水浴中降温，有固体析出时，抽滤即得。中间体I制备中间体II的过程中，为了提高中间体II的收率和纯度，原料优选L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐与中间体I反应。步骤(2)中中间体I制备中间体II的过程中所采用的L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐的制备步骤为：
在1000ml三口瓶中加入100gL-亮氨酸，280ml醋酸叔丁酯，114g 高氯酸，在10℃左右搅拌反应36小时，然后加入280ml水，缓慢加入固体碳酸氢钠中和体系，有大量气泡产生；然后调节PH至7左右，过滤分层，水相用100ml醋酸叔丁酯萃取一次，合并有机相，加入 100ml饱和碳酸氢钠水溶液搅拌10分钟，分层后有机相依次用100ml 饱和碳酸氢钠水溶液、100ml饱和食盐水冲洗，然后用无水硫酸钠干燥；在55℃下减压浓缩，加入200ml石油醚，冰浴下缓慢滴加乙酸乙酯/氯化氢调PH至5，搅拌30分钟后过滤，滤饼用50ml石油醚冲洗后烘干，即得产品，产品外观为白色结晶，收率为29.4％。
(3)由中间体II制备乌苯美司
将所述步骤(2)制备的中间体II用乙醇溶解后，用盐酸调节 PH至1—2，40℃-50℃下搅拌反应4—5小时，体系降至10℃以下，缓慢滴加氢氧化钠溶液，调PH至8以上，过夜，调PH至6—7，减压浓缩，残渣中加入水，4℃—6℃下搅拌结晶，过滤，用1mol/L盐酸溶解，加入少量活性炭，滤除不溶物，用稀氨水调PH5—6，过滤，滤饼用丙酮洗涤，干燥即得。
在本实验步骤中，主要采用脱保护剂将叔丁氧羰酰基、叔丁酯脱去，反应过程很难控制，脱保护剂有多种，优选酸碱脱去，酸碱分别 为稀盐酸、氢氧化碱，在本实验中，中间体II用乙醇溶解后，用盐酸调节PH至1—2，反应后，待温度降低至10℃以下后，采用氢氧化钠溶液调PH至8以上，且采用缓慢滴加氢氧化钠的方式，与其他脱保护剂相比，该酸碱脱保护剂制备获得的乌苯美司成品的收率和纯度最佳。
[1] 柱前衍生化法测定 L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐的对映异构体
[2] CN201410784653.3一种乌苯美司的新型合成工艺