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鲁米诺是一类氨基邻苯酰肼类物质，是最早在CLIA中使用的一种常见的化学发光物质。鲁米诺在水溶液中的化学发光量子产率为1.0％～1.5％，最大发射光波长为425 nm，利用氨基与其他化合物连接。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体，但当它标记到抗原或抗体分子上后，发光活性明显降低，光子产率降为原来的10％，主要原因是标记后产生空间位阻。
制备原理：
3一硝基一邻苯二甲酸(3-nitrophthalic acid)是制备化学发光剂鲁米诺的原料，经脱水后得到的3一硝基一邻苯二甲酸酐可用于有机合成和醇类测定。邻苯二甲酸酐经直接硝化，既可获得3一硝基一邻苯二甲酸．同时也会得到4一硝基一邻苯二甲酸。在3一硝基一邻苯二甲酸分子中，硝基对邻位羧基影响很大，它和羧酸会形成分子内氢键，加上相邻二羧基之问存在的分子内氢键，对整个羧酸分子的解离产生显著的抑制作用，从而导致其水溶性下降。在4一硝基一邻苯二甲酸中，硝基与羧酸之间难以形成分子内氢键，因而，它在水中的解离度相对要大一些，水溶性也好一些。邻苯二甲酸酐硝化后产生的异构体正是利用它们在水溶性上的差异加以分离的。其反应式如下：
许多化学反应都是以热的形式释放能量，也有一些化学反应主要是以光的形式释放能量，鲁米诺(1umino1)在碱性条件下与氧分子的作用就是一个典型的化学发光例子。一般认为，鲁米诺在碱性溶液中转变为二价负离子，后者与氧分子反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定而发生分解，导致形成一种具有发光性能的电子激发态中间体。其过程如下：
现已证实，发光体是3一氨基一邻苯二甲酸盐二价负离子的激发单线态。当激发单线态返回至基态时，就会产生荧光。激发态中间体也可将能量传递至激发态能量较低的受体分子，受激发的受体分子再通过发出荧光释放能量恢复到基态。不同受体分子的激发态能量的差异使其发出的荧光各不相同，这些现象在本实验中可观察得到。
1．3一硝基一邻苯二甲酸的合成
在100 mL三口烧瓶上，配置磁力搅拌器、温度计、冷凝管和滴液漏斗，加12 mL浓硫酸和12 g邻苯二甲酸酐。加热并开动搅拌器，当反应混合物温度升至80℃时停止加热。将i0 mL发烟硝酸自滴液漏斗慢慢滴人烧瓶中，滴加速度以维持
反应混合物温度在100～110℃为宜。
加完硝酸后，继续加热并搅拌l h，温度控制在100℃。然后，让反应液冷却。在通风橱中将反应液慢慢倒入盛有40 mL冷水的烧杯中。当有固体析出时，倾去酸液，再向烧杯中加入10 mL水，用玻璃棒充分搅拌，使副产物4一硝基一邻苯二甲酸溶于水。过滤，收集固体，即得到3一硝基一邻苯二甲酸粗产物。
3一硝基一邻苯二甲酸粗产物可用水重结晶，在重结晶时，每克粗产物约需2．3 mL的水。产物熔点为215～218℃。
2．鲁米诺的合成
将1．3 g 3-硝基一邻苯二甲酸和2 mL lO％水合肼置于100 mL二口烧瓶中，加热溶解。然后加入4 mL二缩三乙二醇，将二口烧瓶固定在铁架台上，加入沸石，插入温度计，用一导管将烧瓶通过安全瓶与水泵相连。打开水泵，加热烧瓶．瓶内反应物剧烈沸腾，蒸出的水蒸气由导管抽走。大约5 min后，温度快速升至200℃以上。继续加热，使反应温度维持在210～220℃约2 min。打开安全瓶上的活塞，使反应体系与大气相通，停止加热和抽气。让反应物冷却至100℃，加入20 mL热水(加热后再冷却，所获粗产物容易过滤)，进一步冷却至室温，过滤，收集浅黄色晶体，即得到5一硝基一邻苯二甲酰肼中间体，中间体不需要干燥即可用于下一步的反应。
将5一硝基一邻苯二甲酰肼中间体转入烧杯中，加入6．5 mL lo％氢氧化钠溶液。用玻璃棒搅拌使固体溶解。加人4 g二水合连二亚硫酸钠，然后加热至沸并不断搅拌，保持沸腾5 min。稍冷却，加入2．6 mL冰乙酸，继而在冷水浴中冷却至室温．有大量浅黄色结晶析出。抽滤，水洗3次，再抽干，收集终产物5一硝基一邻苯二甲酰肼(鲁米诺)。取少许样品，干燥后测定熔点(熔点为319～320℃)。
在250 mL锥形瓶中．依次加入15 g氢氧化钾、25 mL二甲亚砜和0．2 g未经干燥的鲁米诺，盖上瓶塞，然后剧烈摇荡，使溶液与空气充分接触。此时，在暗处就能观察到从锥形瓶中发出的微弱蓝色荧光。继续摇荡并不时地打开瓶塞，让新鲜空气进入瓶内，瓶中的荧光会变得越来越亮。
将不同荧光染料(1～5 mg)分别溶于2～3 mL水中，并加入鲁米诺二甲亚砜溶液中，盖上瓶塞，用力摇动。在暗室里可以观察到不同颜色的荧光。部分结果见下表。
[1]李天星，陈建明，蒲晓允，赵树铭主编，现代临床医学免疫学检验技术,军事医学科学出版社，2014.09，第18页
[2] 何树华，朱云云，陈贞干主编；田光辉，田春良，徐翠莲等副主编，有机化学实验，华中科技大学出版社，2012.08，第237页