酶联免疫吸附实验原理及分类

  ELISA是最经典的一种免疫学实验操作，中文名字叫酶联免疫吸附实验。其原理就是利用抗体能和对应的抗原蛋白分子特异结合，同时通过抗体上的酶联标记与底物反应显色或被激发而发光，最终间接完成抗原抗体复合物的观察、检测与定量。

图1 为elisa原理

  其实elisa和westernblot很像，不同的是后者的待测物也就是蛋白质，通常是在细胞内，因此需要提取蛋白质才能进一步分离和检测；而elisa的待检测物通常已经从细胞内分泌出来到培养液中，因此他的前处理步骤更简单。

图2 比色法蛋白质印迹检测示意图

  几种不同的elisa方法对比

  ELISA根据检测方法分为好几类，分别是直接法、间接法和夹心法。

  直接法就是待检测抗原黏附在微孔板的孔内，然后使用带酶标的一抗与抗原结合，对吼加入底物进行显色，并检测吸光度，由于吸光度的大小与抗原抗体复合物的数量成一定的线性关系，也就间接的实现了测定抗原数量的目标。

  间接法和直接法的区别在于两种抗体代替一种抗体，结合抗原的抗体（一抗）不带酶标记物，当抗原抗体结合后再使用酶标记的二抗结合一抗加入底物显色并检测。

  在间接法的基础上，又再发展出更为复杂的夹心法，它在微孔板底部预先包被一种捕获抗体，用于结合抗原，在这个复合物的基础上再结合一抗、二抗并检测。

  上述三种方法各有特点，目前来看夹心法的ELISA应用最普遍，下面这个表格总结不同方法特点：

  接下来，我们继续了解几种比较特别的ELISA实验法，首先是竞争法。如果待测抗原特别小，无法同时结合

  捕获抗体和一抗的话，就不适合用夹心法检测，此时可以在微孔板孔内包被抗体，同时提供带标记的同种抗原，把待测抗原和标记抗原一起加入和抗体结合，由于两者会竞争结合抗体，所以最终检测的信号越高，证明待检测抗原越少，反之则越多。

  另一种比较特别的是叫elispot,用于检测细胞分泌出来的蛋白和细胞因子。预先在孔内包被捕获抗体，加入未处理/预先处理的细胞，当细胞分泌出特定蛋白或细胞因子时，就会被抗体捕获。细胞裂解后孔内只剩下细胞因子与捕获抗体的复合物，此时再加入能结合的细胞因子的带生物素标记的抗体。最终通过显色形成的斑点来计算分泌蛋白的数量。

图3 为elispot实验示意图

  最后一种就是in-cellelise。这种检测在细胞培养板内进行，细胞是正常生长的，在孔内加入一抗结合细胞表面的特异蛋白，然后通过酶标二抗结合一抗后进行观察。二抗可以是荧光标记也可以是酶联标记