ELISA实验怎么操作？elisa实验步骤详解

 　　ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高校催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。根据检测时标本以及检测目的等的不同具体可以设计出不同类型的ELISA方法，例如间接法、双抗体夹心法和竞争结合。

　　实验前准备

　　先准备好本次实验所需的各种试剂和耗材

　　1.试剂：

　　人TNF-αELISA试剂盒，包含：

　　预包被抗人TNF-α单抗的96孔酶标板

　　冻干的人TNF-α标准品

　　样品稀释液

　　生物素标记的TNF-α抗体(或浓缩液，需自行稀释)

　　亲和素-HRP(或浓缩液，需自行稀释)

　　TMB(POD)显色底物

　　终止液

　　洗板液(浓缩液或即用型)

　　2.耗材：

　　1.5mL离心管

　　QSP盒装吸头(10µL,100µL,1000µL等，根据需要选择)

　　冰盒

　　ELISA盖板膜

　　3.仪器设备：

　　单通道移液器(可根据需要添加多通道移液器)

　　全波长扫描多功能读数仪(酶标仪)

　　涡旋振荡器

　　4.其他：

　　量筒/烧杯

　　吸水纸

　　计时器

　　实验操作

　　样品稀释

　　1.准备稀释液：将冻干的人TNF-α标准品用适量超纯水复溶，配制成浓度为2000pg/mL的标准品原液（或储备液）。

　　2.标记离心管：取8只1.5毫升离心管做好浓度标记，按照浓度从高到低依次排列，并标明单位。假设你想要配置的是从1000pg/mL开始，5倍系列稀释的标准品，那么8个离心管的浓度标记应该是：

　　1000pg/mL

　　200pg/mL

　　40pg/mL

　　8pg/mL

　　1.6pg/mL

　　0.32pg/mL

　　0.064pg/mL

　　0pg/mL(空白对照，通常用稀释液代替)

　　3.加入稀释液:在1000pg/mL到0.064pg/mL的7个离心管中，分别加入400µL稀释液。在0pg/mL的空白对照管中加入900µL的稀释液。

　　4.配制1000pg/mL标准品:吸取100µL2000pg/mL的标准品原液加入到含有400µL稀释液的1000pg/mL离心管中，充分混匀。

　　5.系列稀释:从1000pg/mL的离心管中吸取100µL，加入到200pg/mL的离心管中，充分混匀。更换新的枪头。从200pg/mL的离心管中吸取100µL，加入到40pg/mL的离心管中，充分混匀。更换新的枪头。以此类推，直到稀释到0.064pg/mL。每次转移都必须更换新的枪头。

　　6.空白对照:0pg/mL的离心管中不加标准品，只含有900µL的稀释液。

　　免疫反应

　　接下来进入免疫反应实验，将所有试剂从冰箱中取出，平衡至室温。

　　按照50µL/孔的体积，将空白对照、标准品和稀释后的待测样品加入到酶标板中。注意标准品按照浓度梯度依次加样，并做好标记。

　　加样完毕后，轻轻拍打酶标板，使液体充分混匀。用封板膜封住酶标板，室温孵育1小时。孵育结束后，揭去封板膜，弃去孔内液体，用洗板液洗涤酶标板3次。

　　按照100µL/孔的体积，加入按说明书稀释好的生物素标记的TNF-α二抗，用封板膜封住酶标板，室温孵育1小时。孵育结束后，揭去封板膜，弃去孔内液体，用洗板液洗涤酶标板3次。

　　按照100µL/孔的体积，加入按说明书稀释好的HRP，用封板膜封住酶标板，室温避光孵育30分钟。孵育结束后，揭去封板膜，弃去孔内液体，用洗板液洗涤酶标板3次。

　　按照100µL/孔的体积，加入TMB显色底物，用封板膜封住酶标板，室温避光孵育30分钟(具体时间请参考试剂盒说明书)。

　　加入终止液(例如硫酸或盐酸)终止反应。在酶标仪上，选择合适的波长(例如450nm,405nm或490nm，请参考试剂盒说明书)读取各孔的OD值。

　　最后大家可以进行实验的结果分析，因为篇幅有限，实验操作步骤分享到这里，上述实验步骤仅供参考。如果您对ELISA实验步骤进一步了解，可以和纪宁生物在线顾问寻求帮助!纪宁生物也提供代测服务。