纪宁生物辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒测定原理
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注 意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
测定原理：
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+
为 NADPH，从而检测 NADP+含量。
所需的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
NADP+和 NADPH 的提取：
1 血清（浆）中 NADP+和 NADPH 的提取
NADP+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2 组织中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加
入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃
离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，
置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积
（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率
20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，
10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心
10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：碱性提取液体积
（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率
20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，
10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心
10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样）：
混匀，取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。
注意事项：
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管
加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：
（1）将测定管避光静置时间20min延长到60min；
（2）在提取
阶段增加取样量，即取 0.2g样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48个NADP+或 NADPH.
NADP+和 NADPH 含量的计算：
（一）NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.0985x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 为△A，x 为 NADP+浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+
(nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADP+
(nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADP+
(nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）
（二）NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.6198x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中 y 为△A，x 为 NADPH浓度nmol/mL
1、血清（浆）中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：
0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
注 意：最低检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot
上海纪宁生物一直致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒的科研试剂和完善的技术服务，满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
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