细胞培养：细胞复苏流程及注意事项

     细胞复苏是生命科学和医学领域的关键程序。确保温和地解冻冷冻细胞对于保持其活力和功能至关重要。细胞复苏是细胞培养第一步，因此这一步是非常关键的。了解细胞复苏及步骤对于后续细胞培养比较关键，今天，为大家介绍一下细胞培养之细胞复苏。

    细胞复苏的原理

    细胞复苏是指将冻存在液氮或者零下七十度冰箱中的细胞解冻后重新培养，使解冻后细胞重新恢复其生物活性和功能的过程，包括恢复正常的形态、贴壁、生长和增殖等。在细胞复苏过程，要遵循原则是“慢冻快溶。”其目的是防止细胞解冻过程水份进入细胞、形成冰晶而影响细胞存活。

    细胞复苏步骤

    从液氮罐取出冻存管，应立即放入三十七度水浴锅中，不时轻柔摇动，使其1-2分钟内极速融化。注意在冻存管放入水浴锅中水位应该低于冻存管的盖子， 避免水进入冻存管造成污染。

    待完全融化后，冻存管取出用百分之七十五的酒精擦拭冷冻管外杀菌后，待酒精恢发，打开盖子取出冻存管细胞悬浮液，缓慢滴加到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，如果细胞数量较少，建议先用T25培养瓶，待细胞生长至一定密度后再传代至T75培养瓶，这样可以提供更适宜的生长环境。在37℃、5%CO培养。如果细胞在冻存中用到细胞冻存液，冻存液含有DMSO，DMSO对细胞有一定毒性，建议在细胞复苏后进行一次低速离心（例如1000rpm，5分钟），去除含有DMSO的冻存液，再用新鲜培养基重悬细胞，可以减少DMSO对细胞的损伤，提高细胞活力。

    用培养液稀释适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO培养，二十四小时后，更换新鲜培养基，去除死细胞，三天进行更换一次，当细胞长到有80-90%汇合进行传代。

    细胞复苏过程注意事项

    1）在取冻存细胞时应做好个人防护工作，戴好手套和护目镜。由于解冻时冻存管的温度急剧上升，将可能会发生破裂和泄露。因此为了避免冻存管安全问题，给大家总结如下建议：

    1.选择高质量的冻存管:选择正规厂家生产的、质量可靠的冻存管，确保其能够承受温度的剧烈变化。

    2.检查冻存管密封性:在使用前，仔细检查冻存管是否有裂缝或破损，确保其密封性良好。

    3.使用专用冻存盒:使用带有透气孔的专用冻存盒来保存和取出冻存管，可以减少液氮进入管内的风险。

    4.快速解冻，但避免温度骤变:将冻存管从液氮中取出后，要尽快放入37度水浴锅中解冻，但要避免将冻存管直接扔进水浴锅，可以先用手握住冻存管几秒钟，使其稍微回温，然后再放入水中。

    5.水浴时，水位低于盖子:水浴过程中，要确保水位低于冻存管的盖子，避免水进入管内。

    6.戴防护装备:进行细胞复苏操作时，要佩戴防护眼镜和手套，以防万一发生意外。

   2） 细胞放入水浴锅中复苏时，用镊子夹住细胞冻存管，并在水浴中轻柔的摇动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅中的水进入细胞冻存管造成细胞污染。

    3）打开细胞冻存管之前需用酒精棉球将冻存管消毒后并晾干，细胞复苏后，我尽快恢复到正常的生理状态，所以应该尽快将其转移到37℃的培养箱中。

    4）解冻时间在1-2分钟完成，整个过程尽量避免吹打细胞，导致细胞复苏后生长状态不佳。细胞悬浮 可以用轻轻摇晃或者倾斜混匀的方式代替。

    5）细胞复苏过程尽量避免冻存管沾水，防止支原体污染，实验室定期用过氧化氢熏蒸，细胞小黑点增多时用支原体检测试剂盒检测，并且及时清除。