纪宁生物甲醛脱氢酶(FDH)测试盒测定原理
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注 意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物，对所有生物都具有很高毒性。甲醛
脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶（ADH）的家庭成员之一，广泛存在于原核和真核生物中，该酶能利用 NAD+
作为辅酶，将有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途径中的关键酶。
测定原理：
甲醛脱氢酶催化甲醛和 NAD+产生 NADH，在 340nm 处的吸光值会增加，测定 340nm 处的吸光值变化，可
计算得到甲醛脱氢酶的活性。
自备实验用品及仪器：
天平、离心机、分光光度计、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 15mL 水溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复
冻融。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 3mL 水溶解待用。
试剂四：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
FDH 提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提
取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 20min。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL
提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，
4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 液体：直接检测。
测定操作表：
1、 分光光度计预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 操作表
在比色皿中加入如下试剂
测定管
样本（µL） 100
试剂一（µL） 550
试剂二（µL） 250
试剂三（µL） 50
试剂四（µL） 50
混匀，于 340nm 下测定初始吸光值 A1 与 5min 后的吸光值 A2，△A=A2-A1。
若样本数量较多，可将试剂按比例配成工作液使用。
FDH 酶活计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活（nmol/min/mg prot）= ×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T = 322×△A÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每克样品每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活（nmol/min/g 鲜重）= ×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T =322×△A÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活定义：每 10⁴个细胞每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活（nmol/min/10⁴cell）= ×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个））÷T= 322×△A÷细胞数量
（4）按液体体积计算
酶活定义：每 mL 样本每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活（nmol/min/mL）= ×V 反总÷V 样÷T=322×△A
：NADH 微摩尔消光系数，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，
1mL；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T，反应时间，5min；Cpr：样
本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
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