纪宁生物土壤几丁质酶测试盒测定原理
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土壤几丁质酶（Soil Chitinase，S-Chitinase）试剂盒说明书
注 意 ：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中，而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理：
几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在 585nm 处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器：
天平、水浴锅、离心机、震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板，甲苯、蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 4mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 65mL×1 瓶，4℃避光保存。
样品处理：
新鲜土样风干，过 30-50 目筛。
测定操作表：
对照管 测定管
土样（g） 0.1 0.1
甲苯（μL） 15 15
混匀，25℃静置 15min
蒸馏水（μL） 100
试剂一（μL） 100
混匀，37℃培养 24h
蒸馏水（μL） 200 200
4000rpm，4℃，离心 10min，取上清 200μL 于新的 EP 管中
试剂二（μL） 20 20
混匀，沸水浴 5min
试剂三（μL） 600 600
混匀，37℃显色 20min，取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，蒸馏水调零，测定 585nm 处吸光值，记为 A 对照管和 A 测定管，ΔA=A 测定管-A 对照管。
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=5.2714x-0.0007，R2=0.9989；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值 ΔA。
酶活性定义：37℃条件下，每克土壤每天分解几丁质产生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
土壤几丁质酶活性（μg/d/g 土样）=（ΔA +0.0007）÷5.2714×V 反总÷W÷T×1000= 598×（ΔA +0.0007）
V 反总：反应体系总体积，0.315mL；W：样本质量，0.1g；T：反应时间，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=2.6357x-0.0007，R
2=0.9989；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为吸光值 ΔA。
酶活性定义：37℃条件下，每克土壤每天分解几丁质产生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
土壤几丁质酶活性（μg/d/g 土样）=（ΔA +0.0007）÷2.6357×V 反总÷W÷T×1000= 1195×（ΔA +0.0007）
V 反总：反应体系总体积，0.315mL；W：样本质量，0.1g；T：反应时间，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL
注意事项：
试剂一充分混匀后再使用。
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