纪宁生物为您介绍碱性蛋白酶(AKP)测试盒测定意义
注 意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰
胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
测定原理：
在碱性条件下，AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在 680nm
有特征吸收峰，测定 680nm 吸光度增加速率，来计算 AKP 活性。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、0.5 mL EP 管和
蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 5mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 10mL 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一
层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出
现颗粒物不溶物不影响使用）。
试剂四：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加 20mL 蒸馏水溶解。
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体 1mL×1 支，0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试
剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培养液：直接测定。
3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞
加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后
8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于 40℃水浴保温 30min。
3. 对照管：取 0.5 mL EP 管，加入 20 μL 粗酶液，40 μL 试剂二，混匀后置于 40℃水浴保温 10min；加入 40μL
试剂三，混匀后 8000g ，4℃离心 10min；取 40μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 200μL 试剂四，40μL
试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温 20min，吸取 200μL 于 680nm 测定光吸收，记为 A 对照管。
4. 测定管：取 0.5 mL EP 管，加入 20μL 粗酶液，40μL 试剂三，混匀后置于 40℃水浴保温 10min；加入 40μL
试剂二，混匀后 8000g，4℃离心 10min；取 40μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 200μL 试剂四，40μL
试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温 20min，吸取 200μL 于 680nm 测定光吸收，记为 A 测定管。（注意与空
白管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5. 空白管：取 0.5 mL EP 管，加入 40μL 蒸馏水，200μL 试剂四，40μL 试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温
20min，吸取 200μL 于 680nm 测定光吸收，记为 A 空白管。
6. 标准管：取 0.5 mL EP 管，加入 40μL 标准品，200μL 试剂四，40μL 试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温
20min，吸取 200μL 于 680nm 测定光吸收，记为 A 标准管。
上海纪宁生物生物一直致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供碱性蛋白酶(AKP)测试盒科研试剂和完善的技术服务，满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
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